Chitosan and polylactide scaffolds biocompatibility characterisation for human mesenchymal stem cells

Abstract

Full Text

Эффективность полимерных материалов в качестве носителей для мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) определяется в первую очередь их адгезивными свойствами и отсутствием токсического воздействия на клетки. Удобными критериями оценки биосовместимости полимерных носителей являются сохранение способности клеток к пролиферации и дифференцировке при культивировании на полимере. ММСК пролиферируют медленно, поэтому важно выяснить, можно ли в качестве критерия биосовместимости материала потенциального носителя и ММСК использовать параметры его взаимодействия с клетками эпителиального происхождения и фибробластами. Цель исследования: сравнение биосовместимости волокнистых и пленочных носителей на основе хитозана и полилактида для клеток человека эпителиального происхождения линии MCF-7, для фетальных фибробластов LECH и ММСК. Материал и методы. Клетки человека линии MCF-7 и легочные фетальные фибробласты человека LECH культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей оыворотки и 50 мкг/мл гентамицина. ММСК выделяли из липоаспирата подкожной жировой клетчатки здоровых добровольцев в соответствии оо стандартным протоколом. Для определения уровня экспрессии отдельных маркеров ММСК, их инкубировали с меченными ФИТЦ антителами к соответствующим антигенам, затем измеряли интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL. Размер фракции SP (суррогатный маркер стволовых клеток) в культурах ММСК определяли после окрашивания родамином-123 с помощью проточной цитометрии. Для оценки биосовместимости в лунки 24-луночного планшета с полимерами (хитозан, полилактид в виде пленочных и волокнистых материалов размером 1x1 см) и без (контроль), вносили по 100 тыс. клеток в 500 мкл полной культуральной среды и инкубировали в течение 24, 72, 96 ч. Морфологию и жизнеспособность клеток определяли с помощью световой микроскопии и регистрировали цифровой камерой. Для оценки уровня адгезии через 3 сут. клетки снимали с пластика с помощью 0,05% раствора трипсина в растворе Версена и определяли их количество с помощью камеры Горяева. Выживаемость клеток после инкубации на полимерных матрицах оценивали с помощью МТТ-теста по методу Mosmann. Результаты. При исследовании способности клеток линий MCF-7 и LECH к адгезии на пленочных материалах из хитозана и полилактида, было обнаружено, что количество прикрепившихся клеток через 24 ч составило 30% на пленке из полилактида и 10% на пленке из хитозана. При этом распластывались и имели морфологию, характерную для эпителиальных клеток и фибробластов, только клетки на пленке из полилактида. При культивировании клеток линий MCF-7 и LECH в течение 72-120 ч на волокнистых и пленочных полимерах показано, что клетки прикреплялись и пролиферировали на всех полимерах, но наиболее активно - на пленочных материалах (скорость пролиферации клеток линии LECH на пленках была в 5 раз выше по сравнению с волокнистыми материалами). Наиболее высокая скорость пролиферации наблюдалась при культивировании клеток на пленке из полилактида. При сопоставлении выживаемости клеток линии LECH с уровнем гидрофильности поверхности полимеров, определяемой по значениям угла смачивания, оказалось, что скорость пролиферации достоверно коррелировала со степенью гидрофильности и волокнистых и пленочных полимеров (р<0,001). Для анализа биосовместимости пленки из полилактида с ММСК использовали недифференцированные ММСК после шестого пассажа. Предварительный анализ поверхностных антигенов ММСК с помощью проточной цитофлуориметрии показал, что клетки ММСК экспрессируют типичный набор поверхностных антигенов CD44, CD75, CD90, CD105, менее 8% клеток экспрессировали HLA-DR и, кроме того, 1% клеток - рецептор АФП (маркер эмбриональных клеток), в то время как экспрессия CD14, CD34, CD45 не выявлялась. Фракция SP в ММСК составляла 15%, в присутствии верапамила она уменьшалась до 7%. Окрашивание клеток ММСК суданом III после длительного культивирования в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки без добавления индукторов дифференцировки, показало, что содержание адипоцитоподобных клеток с липидными вакуолями в такой культуре составляет менее 1%, что свидетельствует о низком уровне спонтанной дифференцировки клеток. Через 24 ч культивирования ММСК на пленке из полилактида уровень прикрепления клеток составил 40% (40 тыс. кл./см2). На этом носителе клетки сохраняли жизнеспособность в течение 96 часов культивирования. Выводы. Культивирование клеток на волокнистых полимерах из полилактида и хитозана неэффективно из-за их низких адгезивных свойств. Для предварительной оценки биосовместимости полимерных материалов и ММСК можно и целесообразно использовать перевиваемые линии клеток, такие как MCF-7 и LECH. ММСК с высокой эффективностью прикрепляются к матрицам из полилактидной пленки и остаются жизнеспособными в течение длительного времени, что позволяет рассматривать такие пленки в качестве эффективного носителя клеток.