Morpologycal aspects of the cultivation of limbal cells on the amnion

Abstract

Full Text

Ввведение. В последние годы в клинической медицине заметно возрос интерес к использованию тканей, представляющих собой биогенные стимуляторы. Одной из таких тканей является амниотическая оболочка - самый внутренний слой зародышевых оболочек человека. Амниотическая мембрана (АМ) человека обладает высокой прочностью и пластичностью и не препятствует прохождению лекарственных веществ из конъюнктивальной полости, что дает возможность использовать ее в качестве универсального биологически активного барьера. Кроме этого, амниотическая оболочка является полупрозрачной и позволяет беспрепятственно наблюдать за динамикой патологического процесса в роговице. Имеется множество противоречивых публикаций по поводу правильного расположения амниона на поверхности глаза. Оболочка может быть пришита к глазной поверхности основной мембраной эпителия обращенной вверх и стромальной стороной, обращенной вниз к глазу (предпочтительная техника) или стромальной стороной амниона вверх. Использование свойств АМ и послойное культивирование клеток роговицы приближает к идее о создании искусственной роговицы. Цель. Провести сравнение послойного культивирования лимбальных и эпителиальных клеток роговицы человека на стромальной и базальной сторонах амниона. Материал и методы. Для исследования использовали криозамороженную АМ и первичные культуры, выделенные из кадаверных роговиц человека. С помощью фазово-контрастной микроскопии в процессе культивирования были выделены для исследования две субпопуляции клеток роговицы: лимбальные стволовые клетки (ЛСК) и клетки плоского эпителия роговицы человека. Идентификацию двух субпопуляций подтверждали иммуногистохимическими окрашиваниями на специфические маркеры (Р63-маркер недифференцированных стволовых клеток, цитокератин 19, цитокератин 3/12-маркер дифференцированных стволовых клеток, виментин, a-SMA, кератинсульфат). Клеточные культуры были протестированы на контаминацию возбудителями инфекций. После размораживания до комнатной температуры мембрану трижды промывали в растворе PBS (Sigma, США). Затем аккуратно расправляли на стерильной фольге и разрезали на небольшие кусочки размером 1x1 см2. В 4-луночную плату (u-Slide 8 well, IBIDI, Gmbh) помещали два образца базальной мембраной вверх и два стромальной стороной. Наносили на поверхности амниона по 10 тыс. ЛСК в 0,2 мл питательной среды DMEM/F12 1:1 (Sigma, США), содержащей 10% ЭТС, L-глутамин (Sigma, США), пеницилин 100 ед/мл (Дарница, Украина), стрептомицин 100 ед/мл (Дарница, Украина), эпидермальный и фактор роста фибробластов 10 нг/мл (Sigma, США), инсулин 5 мкг/мл (Sigma, США), трансферрин 5 мкг/мл (Sigma, США), изопротеринол 5 мкг/мл (Sigma, США), гидрокортизон 5 мкг/мл (Sigma, США). Смену сред проводили каждые 48 ч в течение 12 сут. Культивирование осуществляли в стандартных условиях в СО2 инкубаторе, с влагосодержанием 95% при температуре 37°С. На протяжении этого периода наблюдали за сменой активности пролиферации клеток, их морфологией. После достижения конфлуэнтного лимбального монослоя на поверхности АМ, наносили суспензию клеток плоского эпителия роговицы человека и культивировали в течение 3-5 дней. Визуализацию клеточных линий на амнионе осуществляли с помощью инвертируемого светового микроскопа Leika PMIL, рабочей станции с обработкой изображения LEIKA QWIN 500 Standart, видеокамеры JVC-С 1380, светового микроскопа Olympus AX 50 и видеокамерой Olympus DR 70. Для оценки морфологической структуры амниона и культивированных клеток роговицы человека использовали иммуногистохимию с окрашиванием специфических маркеров. Результаты. Не составляет сложности определить базальную мембрану и стромальную сторону при первичной заготовке амниона во время кесарева сечения и помещения на нитроцеллюлозную бумагу. Стромальная сторона АМ липкая как стекловидное тело, а сторона базальной мембраны блестящая и не липкая. Определенную трудность составляет дифференцировка сторон у АМ после криозамораживания. Стромальная сторона амниона утрачивает свою липкость. В нашем исследовании для культивирования двух субпопуляций клеток роговицы использовали криозамороженную АМ. Результаты проведенного экспериментального исследования in vitro свидетельствуют о повышенном потенциале пролиферации и дифференциации субпопуляции ЛСК роговицы человека. Специфические маркеры, характерные для этого вида клеток, не экспрессируются в клетках плоского эпителия. Для базальных лимбальных клеток характерна цилиндрическая форма, среди этих клеток большое количество камбиальных, т.е. стволовых. Такие клетки имели высокую пролиферацию (в логарифмической фазе роста время удвоения составляло 14-16 ч), отчетливо идентифицированы ядра с четкими видимыми ядрышками. Шиповатые клетки полигональной формы вклинивались между базальными клетками и составляли совокупность плотно сформированного слоя. Следующий слой плоских клеток, чьи ядра имеют палочковидную форму, расположены параллельно поверхности пласта. Культивирование двух субпопуляций клеток роговицы на стромальной стороне и базальной мембране АМ существенно не отличалось. Выводы. В экспериментальном исследовании достигнута цель получения двух монослоев клеточных субпопуляций на поверхности как стромальной, так и базальной сторон амниона. Культивирование клеток роговицы человека благоприятно осуществляется на любой из поверхностей АМ с учетом правильно подобранных питательных сред. Таким образом, можно надеяться, что созданная модель искусственной роговицы сможет стать альтернативой кератопластики и способна стимулировать процессы репаративной регенерации при повреждениях роговой оболочки.