The osteogenic effect of bone morphogenetic protein-2 on collagen scaffold with fibronectin

Abstract

Full Text

Восстановление тканей в области повреждения может быть существенно ускорено путем привлечения клеток, способных его стимулировать. В процессах клеточной миграции, пролиферации и дифференциации ключевую роль играет группа активных белковых соединений - факторов роста. Костные морфогенетические белки (Bone Morphogenetic Proteins, BMP), являющиеся плейотропными факторами роста, стимулируют формирование новой костной ткани. В частности, BMP-2 индуцирует дифференциацию некоторых мультипотентных клеток в хондрогенные и остеогенные, а также способствует пролиферации остеобластов. Рекомбинантный аналог BMP-2 человека (rhBMP-2) широко используется в клинических исследованиях. Чтобы обеспечить продолжительное действие введенного rhBMP-2 в зоне повреждения костной ткани, необходимо поддерживать его локальную концентрацию на постоянном уровне. Для локализации и продолжительности воздействия рекомбинантного rhBMP-2 в клинике используют коллагеновую губку, при этом доза вводимого местно rhBMP-2 в среднем составляет около 12 мг, что примерно в тысячу больше количества эндогенного BMP-2. Поскольку емкость коллагенового носителя по отношению к rhBMP-2 невелика (около 1 мг rhBMP-2 может связаться с 10 мг коллагена), то использование такого избыточного количества rhBMP-2, несвязанного с коллагеном, приводит к быстрому высвобождению 30-50% рекомбинантного белка в первые дни после имплантации. Для обеспечения более продолжительного высвобождения необходимо снизить количество используемого rhBMP-2, а также обеспечить дополнительные места связывания для фактора роста внутри самого имплантата. Цель исследования: оценка кинетики высвобождения rhBMP-2 из коллагенового носителя, содержащего фибронектин, а также исследование физиологических реакций организма, возникающих при его введении. Материал и методы. Рекомбинантный BMP-2 получали с помощью микробиологического синтеза и очищали по оригинальной технологии (1). В эксперименте in vitro использовали 0,5% раствор очищенного нативного крысиного коллагена и фибронектин плазмы крови человека (Имтек, Россия); свежую плазму крови человека, антикоагулированная ЭДТА. Высвобождение rhBMP-2 из носителей оценивали, инкубируя их в фиксированном объеме цельной плазмы крови человека при постоянном перемешивании. В каждую экспериментальную группу входило по 5 образцов. Перед сменой омывающего раствора часть его отбирали для определения количества вышедшего из геля rhBMP-2. Количественное содержание rhBMP-2 в исследуемых растворах оценивали с помощью специфичной ИФА тест-системы (ООО фирмы «Имтек»). In vivo исследование проводилось на 30 крысах-самцах Wistar. Носитель, коллаген-фибронектиновый матрикс, получали в результате инкубации при 37°С 0,5% стерильного раствора очищенного нативного крысиного коллагена (Имтек, Россия) с фибронектином плазмы крови человека и rhBMP-2 в количестве 100 мкг. В ходе эксперимента носители имплантировали подкожно в паховую область и наблюдали в течение 42 дней. В определенные временные промежутки по 2 крысы выводили из эксперимента передозировкой углекислого газа в CO2 камере, после чего область имплантации материалов тщательно исследовали макроскопически. Коллагеновые гидрогели извлекали; ткани, контактировавшие с ними, фиксировали в 10% формалине, готовили срезы и анализировали методами классической гистологии. Количественное содержание rhBMP-2 в извлеченных гидрогелях оценивали с помощью специфичной ИФА тест-системы (ООО фирмы «Имтек»). Результаты и обсуждение. Измерение кинетики высвобождения rhBMP-2 из коллагеновых носителей in vitro было проведено для коллагенового и коллаген-фибронектинового гидрогеля при инкубации в плазме крови человека при температуре +37°C. Как и ожидалось, коллаген-фибронек-тиновый матрикс продемонстрировал эффективное удержание rhBMP-2 in vitro при инкубации в человеческой плазме крови, но в отличие от аналогичных систем доставки, применяемых в клинике, удалось избежать фазы быстрого высвобождения рекомбинантного фактора роста. Около 20% от введенного rhBMP-2 высвободилось из коллагенового имплантата в течение недели. Аналогичный результат был получен при удержании rhBMP-2 коллаген-фибро-нектиновым матриксом in vivo. Согласно гистологическим данным, мягкие ткани интегрируются с коллагеновым гелем, начиная уже с третьих сут. Сосудистая реакция с клеточной пролиферацией в области имплантации коллагенового гидрогеля направлена на формирование собственного внеклеточного матрикса. Минимальные воспалительные процессы сменяются интенсивным образованием новой соединительной ткани, активно проникающей вглубь материала. А на 42 день после операции было отмечено наличие формирующейся костной ткани. По результатам гистологического исследования можно сделать вывод, что разработанный коллаген-фибро-нектиновый матрикс для доставки rhBMP-2 обладает всеми преимуществами коллагеновых носителей: биосовместим, проницаем для клеток, способствует их адгезии и пролиферации. Сеть фибрилл коллагена и фибронектина, входящих в состав коллаген-фибронектинового матрикса, обеспечивает все условия для презентации rhBMP-2 в малых количествах, при которых сохраняется биологическая активность связанного с фибронектином и коллагеном рекомбинантного фактора роста. Использование малых количеств rhBMP-2 для регенерации костной ткани позволит минимизировать риск возникновения таких побочных явлений, как неуправляемый рост костной ткани в спинномозговой канал, остеолиз, и, как следствие, потеря фиксации имплантата, отек тканей шеи и горла, дисфагию, а также повышенный уровень антител к BMP-2. 1. Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М. и др. Получение рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека в клетках Escherichia coli и тестирование его биологической активности in vitro и in vivo. Молекулярная биология 2010: 44(6): 1036-44.