Study of the neurogenetic differentiation of foetal brain cells in vitro

Abstract

Full Text

Актуальным направлением лечения дегенеративных заболеваний ЦНС является разработка и создание клеточных технологий с использованием нейральных стволовых клеток (НСК) и нейроклеток-прекурсоров (НКП) для восстановления нормальной микроархитектоники нервной ткани. Условиями эффективности клеточной терапии является достаточный объем и адекватный клеточный состав трансплантируемого материала, поэтому особое значение приобретает разработка методов получения в условиях культивирования клеточных популяций с оптимальными характеристиками. Цель исследования: изучение дифференциро-вочного потенциала нейроклеток фетального головного мозга при культивировании в различных условиях. Материал и методы. Материалом для исследования служили НКП фетального головного мозга крысы 12-16 сут. гестации (Е12-16). Все манипуляции с экспериментальными животными проводили, придерживаясь Закона Украины «О защите животных от жестокого поведения», «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, которые используются с экспериментальной и другой научной целью», с учетом принципов биоэтики и норм биологической безопасности. Нейроклетки культивировали в бессывороточной среде ДМЕМ/Б12 (Sigma, Германия). Для индукции дифференцировки в культуры добавляли: препарат инсулин-трансферрин-селенит (ИТС) (PanEco Ltd, Россия), содержащий 0,05 мг/мл инсулина, 0,0275 мг/мл трансферрина, 0,0335 мг/мл селенита; ретинола ацетат (0,2 мг/мл, завод витаминных препаратов, Киев); фетальную сыворотку коров (ФСК) (1% раствор, Украина); ретиноевую кислоту (2х10-6 моль/л, Sigma, Германия). В контрольные культуры факторы дифференцировки не добавляли. Культуры содержали в СО2-инкубаторе при 37°С, наблюдали в инвертированном микроскопе (БИОЛАМ П-3, Россия). Для цитологического исследования на 7, 14, 30 сут. кластеры нейроклеток переносили в пробирки, центрифугировали (3 мин 1000 об./мин), осадок ресуспендировали в среде ДМЕМ/И2 и наносили на адгезивные стекла. По окончании опытов культуры фиксировали в 10% растворе формалина и окрашивали тионином по Нисслю. Иммуногистохимически в нейроклетках выявляли виментин (маркер прогениторных нейроклеток) и глиальный кислый фибриллярный белок (GFAP, маркер глиобластов и астроцитов) с помощью наборов «Sigma Immunochemicals VIMENTIN» и «Sigma Immunochemicals GFAP» (Германия). Цитологические препараты изучали на цитоанализаторе изображения «IBAS-2000» (Германия). Результаты и обсуждение. В контрольных культурах в течение всего периода наблюдения нейроклетки сохраняли шаровидную форму без признаков дифференцировки. В бессывороточной среде ДМЕМ/И2 на 7-9 сут. определялось снижение, а на 10-12-е сут. - нарастание и стабилизация содержания нейроклеток, что отражает наличие среди них долгоживущих НСК. При этом наблюдалось массовое прикрепление к субстрату округленных нейроклеток с минимальным фенотипом, расположенных изолированно или в виде микроагрегатов. НКП длительно сохраняли округлую форму без признаков цитодифференцировки и выявляли экспрессию виментина, подтверждающего их принадлежность к пулу прогениторных нейроклеток. В ходе культивирования доля виментин-по-ложительных клеток увеличилась с 28,6±3,6% на 2 сут. до 77,0±13,9% на 16 сут. В культурах нейроклеток в присутствии индукторов дифференцировки установлено, что наличие в питательной среде ретинола ацетата индуцировало формирование нейросфер; клетки характеризовались морфологической и иммунофенотипической гетерогенностью. При сочетанном последовательном добавлении ИТС и ретинола ацетата в этот срок в культурах появлялись униполярные клетки грушевидной формы с короткими конусовидными отростками (доля таких клеток составляла 8,5%). При добавлении в культуральную среду ретиноевой кислоты среди округленных недифференцированных клеток появлялись отростчатые клетки с обильной цитоплазмой и наличием отростков - коротких конусовидных, а также длинных хорошо выраженных, с признаками ветвления. В ядрах 20-30% нейроклеток треугольной формы выявлялись четко выраженные крупные ядрышки, характерные для нейробластных форм. С увеличением срока культивирования возрастала доля НКП, экспрессирующих виментин - маркер прогениторных клеток с 25% до 80-85%. Количество клеток, экспрессирующих GFAP - маркер глиобластов и астроцитов увеличивалось с 60% до 80%. Таким образом, в культурах НКП фетального мозга крысы в процессе культивирования наблюдалось увеличение пула прогениторных виментин-положи-тельных нейроклеток, а в присутствии ретиноевой кислоты установлена индукция их дифференцировки по нейрональному и глиальному типу. Выводы. Подбор условий культивирования позволяет получить культуры нейроклеток с заданными свойствами: обогащенные виментин+ нейрогенными предшественниками, сохраняющими свою полипо-тентность и способность к дифференцировке в нейрональном и глиальном направлениях.