Porous ceramics based on ZrO2 or Al2O3: physical properties and preliminary evaluation of biocompatibility

Abstract

Full Text

Пористая керамика является перспективным материалом для медицинского применения в области травматологии и ортопедии при восполнении дефектов кости критического размера. При этом пористая керамика может выступать как в качестве непосредственно остеопластического материала, так и как 3D скаффолд при создании тканеинженерного эквивалента кости. Цель исследования: определить физические свойства и получить предварительные результаты по оценке биосовместимости (отсутствие или наличие цитотоксичности; способность поддерживать пролиферацию и направленную остеогенную дифференциацию ММСК из жировой ткани) керамических имплантатов (на основе ZrO2 или Al2O3), изготовленных методом шликерного литья и прессования, с последующим отжигом и спеканием. Материал и методы. В экспериментах были использованы образцы из высокопористой оксидной керамики (на основе ZrO2 или Al2O3), изготовленные методом шликерного литья и прессования, с последующим отжигом и спеканием. Для исследования физических свойств керамических имплантатов были использованы следующие методы: 1) электронная Оже-спектроскопия (ЭОС) - для определения качественных данных об элементах, присутствующих в имплантатах; 2) энергодисперсионный анализ (ЭДС) - для определения элементного состава имплантатов; 3) спектроскопия комбинационного рассеяния света (КРС) - для определения фазового состава имплантатов. Предварительная оценка биосовместимости имплантатов из высокопористой керамики была выполнена в экспериментах in vitro с использованием ММСК из жировой ткани мышей линии FVB (самцы 4-6 месячного возраста). ММСК из жировой ткани выделяли ферментативным методом и культивировали в среде DMEM: F12 с 2 мМ глутамина и 10% фетальной сыворотки коров. Для экспериментов использовали культуру ММСК 4-го пассажа. Для оценки цитотоксичности имплантатов и определения жизнеспособности культивируемых на их поверхности или в их составе ММСК использовали двойное окрашивание клеток флю-оресцеин диацетатом (FDA) и пропидиум йодидом (PI) через 24 ч, 48 ч и 14 дней после засева. Для этого 104 ММСК засевали на пластик в лунки 24-луночной планшеты (контроль), на поверхность или внутрь имплантатов и инкубировали в указанные временные точки после засева в течение 10 мин в растворе Хэнкса, содержащем FDA (2 мкг/мл) и PI (1 мкг/мл), после чего клетки отмывали и исследовали при помощи инвертированного флюоресцентного микроскопа Axio Observer A1 (Саг12е1зз).Такжепроводилинаправленнуюостеоген-ную дифференциацию (по общепринятому протоколу D. Prockop, 2004) ММСК, культивируемых на поверхности или в составе имплантатов в течение 14 дней с последующей оценкой по активности щелочной фосфатазы с использованием субстрата BCIP/NBT (Sigma). Для подтверждения соответствия использованных в эксперименте клеток предъявляемым к ММСК критериям параллельные культуры были исследованы для определения фенотипа клеток и их способности к направленной дифференциации в адипогенном и остеогенном направлении при монослойном культивировании (по стандартным методикам с оценкой дифференциации цитохимическим окрашиванием Oil Red O Alizarin Red S соответственно; D. Prockop, 2004). Фенотип определяли на проточном цитофлюори-метре-сортере «BD FACSAria» с ПО FACSDiva 6.1.1 с использованием анти-мышиных моноклональных антител к CD44, CD45, CD73, CD90 и Sca-1 (все - Becton Dickinson, США). Результаты. Одним из важных аспектов использования пористой керамики в качестве материала для костных имплантатов, является фактор образования прочного соединения с костной тканью. Клетки из жировой ткани, использованные для предварительной оценки биосовместимости пористых керамических имплантатов, обладали способностью к направленной дифференциации в адипо- и остеогенном направлении и имели следующий фенотип: CD44+, CD73+, CD90+, Sca-1+ и CD45-. Комбинированное окрашивание FDA/PI ММСК из жировой ткани, культивируемых на поверхности или в составе имплантатов показало отсутствие цитотоксичности у всех исследованных образцов керамики. Микроскопическое наблюдение показало, что ММСК способны пролиферировать при культивировании в составе исследуемых керамических имплантатов с формированием монослоя на поверхности имплантата или кластеров клеток в порах имплантата. Также культивируемые на поверхности и (или) в составе имплантатов ММСК были способны к направленной дифференцировке в остеогенном направлении, что подтверждено окрашиванием на щелочную фосфатазу - ранний и ключевой маркер остеогенной дифференциации ММСК. Выводы 1. Экспериментально подтвержден заявленный элементный состав образцов. 2. Продемонстрирована высокая степень клеточной адгезии на поверхности имплантатов. 3. Имплантаты не проявляют цитотоксических свойств. 4. Имплантаты поддерживают пролиферацию и направленную остеогенную дифференциацию ММСК.