The study a possibility to use multipotent mesenchymal stromal cells isolated from human gingiva in tissue-engineering construction for periodontal bone repair

Abstract

Full Text

Хронический пародонтит в России наблюдается более, чем у 60% населения старше 30 лет. Прогрессирование же поражения пародонта, как известно, приводит к потере зубов, деструкции и атрофии альвеолярных отростков челюстей. Одним из подходов лечения данной патологии является применение методов пародонтальной хирургии, направленных на ликвидацию патологических зубодесневых и костных карманов, что, практически, всегда требует восполнения убыли костной ткани. Однако, если методы оперативного вмешательства отработаны и стандартизованы, то проблема эффективного восполнения объема костной ткани, по-прежнему остается актуальной. Имеющиеся на сегодняшний день остеопластические материалы не отвечают всем требованиям специалистов. Так, применение аутогенной костной ткани (идеального остеопластического материала) сопровождается нанесением дополнительной травмы пациенту и расширением зоны оперативного вмешательства; недостатком использования синтетических остеопластических материалов является низкая остеоиндукция. В этой связи, разработка биосовместимого тканеинженерного конструкта (ТИК), содержащего клетки с высокой способностью к остеогенной дифференцировке является одним из наиболее перспективных подходов к решению данной непростой проблемы. В качестве клеточного материала представляется весьма перспективным использование мультипотентных мезенхимальныхх стромальных клеток, выделенных из десны пациента (ММСКд). Выбор данного источника клеток обусловлен легкой доступностью получения биоматериала и малой травматич-ностью для пациента. В качестве сравнения использовали ТИК с иммобилизованными на носителе мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками, выделенными из костного мозга человека (ММСКкм), которые, как известно, обладают высоким остеогенным потенциалом. Материал и методы. Первичные культуры ММСКд получали из биоптатов десны и подвздошной кости здоровых доноров (возраст 25-50 лет). Экспрессию генов - коллагена I, III типа, эластина и виментина определяли методом иммунофлуоресцентного анализа с использованием первичных анти-ген-специфичных и вторичных флуоресцентно-меченых антител. Поверхностные маркеры анализировали методом проточной цитофлуориметрии. В работе использовали флуоресцентные антитела к маркерам гемопоэтических (CD34, CD45), мезенхимных (CD73, CD90, CD105) и эпителиальных (цитокератины 14, 15, 16 и 19, CD324) клеток. Для функциональной идентификации клеток использовали набор R&D Systems (США), в состав которого входят специфические индукционные среды и антитела (FABP4, аггрекан, остеокальцин) для детекции адипо-, хондро- и остеодифференцировки клеток. Для определения эффективности остеогенеза использовали гетеротопическую модель с подкожным введением трикальцийфосфатного (ТКФ) материала (различные его модификации, синтезированные в ИМЕТ РАН), с иммобилизованным на нем клеточным материалом, бестимусным мышам с последующим иммуногистохимическим анализом срезов полученного биоматериала. Результаты. Иммунофенотипический анализ клеток, выделенных из десны и костного мозга человека, продемонстрировал отсутствие у них гемопоэтических (CD34, CD45), эпителиальных (цитокератины 14-16, 19) и наличие мезенхимных (CD73, CD90, CD105) поверхностных маркеров. Клетки экспрессировали внутриклеточные маркеры фибробластов - коллагены I, III типа, эластин и виментин. Общий антигенный профиль исследуемых ММСКд, выделенных из десны и костного мозга - сходен. Дифференцировочный анализ показал, что ММСКд, также как и ММСКкм, под действием специфических факторов способны дифференцироваться в различных направлениях, приводя к появлению в культурах клеток с фенотипом и белковыми маркерами, характерными для остеобластов, хондроцитов, адипоцитов и миофибробластов. При этом при дифференцировке in vitro под действием остеогенных индукционных факторов в течение 14 дней ММСКд и ММСКкм регистрируются основной белок остеобластов - остеокальцин и процессы минерализации. Гистологический анализ срезов биоматериала, полученных при подкожном введении ТКФ и ТИК бестимусным мышам, показал, что в случае комбинации клеток с носителем наблюдается значительно более выраженная экспрессия остеокальцина, чем при использовании носителя без клеток. При использовании ТИК отмечена также их значительная васкуляризация - одно из важнейших условий нормального остеогенеза. Сравнение эффективности стимуляции остеогенеза ММСКд и ММСКкм показало, что в первом случае остеогенные процессы носят более выраженный характер. Среди различных модификаций ТКФ наиболее эффективным носителем зарекомендовал себя ТКФ с пористой/фестончатой структурой, обладающей максимальной клеточной емкостью. Выводы. Полученные результаты позволяют заключить, что мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из десны, можно рассматривать в качестве оптимального клеточного компонента в тканеинженерном конструкте для восстановления костных тканей пародонта. В качестве носителя оптимально использовать ТКФ с пористой/ фестончатой структурой, обладающей максимальной клеточной емкостью. Не вызывает сомнений перспективность использования такого тканеинженерного конструкта, как альтернативного остеопластического материала для восстановления костных тканей пародонта.