Deriving population of ectomesenchymal cells with properties of stem cells and progenitor cells from pulp of permanent teeth

Full Text

Одним из важных вопросов биологии развития, стоматологии и регенеративной медицины является проблема наличия в пульпе зуба стволовых клеток, потомки которых могут дифференцироваться в одон-тобласты. Интерес к этому вопросу поддерживается тем, что за последние годы были проведены многое-mail: Sagitov@me.com численные исследования, в которых авторы утверждают, что им удалось выделить стволовые клетки пульпы зуба. Стволовые клетки были получены из пульпы временных зубов [1], зубного зачатка [2] и его оболочки [3], пульпы постоянных зубов [4, 5]. Во всех этих исследованиях были получены клетки с фенотипом мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК). В частности, полученные клетки экспрессировали CD44, CD106 [4], STRO-1, CD146 [1], нестин и виментин [3]. При культивировании этих клеток с добавлениями различных ростовых факторов или факторов дифференцировки - костный морфогенетический белок (КМБ), фосфопротеин дентинного матрикса 1 [5], КМБ-2 [3], КМБ-4 [1] добивались дифференцировки клеток в остеогенном и адипогенном направлениях. Одонтогенная дифференцировка наблюдалась только в том случае, когда в культуру добавляли кислый фосфопротеин дентинного матрикса 1 [5] и КМБ-4 [1]. Большинство клеток, которые были описаны до этого как стволовые клетки пульпы зуба, представляли собой гетерогенную популяцию ММСК, источником развития которой является как мезодерма, так и нервный гребень [6]. В отличие от ММСК костного мозга или жировой ткани, одонтобласты не являются истинно мезенхимальными клетками и относятся к клеткам, так называемой, эктомезенхимы [7], то есть к производным мезенхимных клеток, берущих начало из региона нервного гребня. Кроме свойственных нервной ткани маркеров, в частности нестина [8], дифференцирующиеся одонтобласты экспрессируют цитокератин (ЦКР) 19 [9] - белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток. Как показали ранее проведенные исследования, одонтобластам присущ ряд признаков, характерных для эктодермальных клеток, такие как экспрессия эпителиального мембранного антигена (ЭМА) и цитокератина 18. Более того, было обнаружено, что клетки промежуточного слоя, прилежащего к одонтобластам, наряду с эпителиальными маркерами экспрессируют ряд маркеров стволовых клеток, в частности C-kit - рецептор фактора стволовых клеток [10]. Цель работы - получить из пульпы постоянных зубов популяции эктомезенхимных клеток со свойствами стволовых и прогениторных клеток и охарактеризовать их фенотип in vitro. материал и методы В качестве материала исследования использовали пульпу постоянных зубов пациентов в возрастной категории 18-29 лет, удаленных по ортодонтическим показаниям (всего 15 зубов). Удаленные зубы помещали в раствор фосфатно-солевого буфера со смесью антибиотиков (100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия)). Затем равномерной механической нагрузкой зубы раскалывали с помощью молоточка и свинцовой пластинки и в последующем осторожно стерильным пинцетом извлекали цельную пульпу. В стерильных условиях пульпу измельчали и переносили в шестилуночный планшет. Культивирование клеток было проведено в питательной среде аМЕМ (ПанЭко, Россия) с 10% содержанием сыворотки плодов коровы (FBS, ПанЭко, Россия), 100 Ед/мл пенициллина-100 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия) и 146 мг L-глутамина (ПанЭко, Россия) в инкубаторе при 37°C во влажной атмосфере 5% СО2. Каждые 2 дня проводили замену питательной среды. Всего было выполнено 5 пассажей. Фенотип полученных клеток исследовали на 3 день каждого пассажа методом иммуноцитохимического окрашивания. Окрашивание антителами к ЭМА, C-kit, и ЦКР19 проводили во всех пассажах, антителами к эпителиальному специфическому антигену (ЭСА), а-гладкомышечному актину (аГМА), десмину, ви-ментину, ядерному антигену пролиферирующих клеток (ЯАПК) и Bcl-2 в 3 и 5 пассажах. Для проведения иммуноцитохимического анализа использовались антитела, которые представлены в таблице. антитела, использованные для анализа клеток, выделенных из пульпы постоянных зубов человека, методами иммуноцитохимии и проточной цитофлуориметрии Антиген Клон, разведение Фирмапроизводитель Виментин - белок промежуточных филаментов цитоскелета мезодермальных клеток 3В4, 1:75 Dako, Дания Десмин - белок промежуточных филаментов цитоскелета мышечных клеток D33, 1:30 Dako, Дания а-ГМА - альфа-гладкомышечный актин, маркёр миофибробластов, гладкомышечных клеток 1A4, 1:50 Dako, Дания ЯАПК (PCNA) - ядерный антиген пролиферирующих клеток PC10, 1:50 Dako, Дания C-kit (CD117) - рецептор к фактору стволовых клеток, маркёр стволовых и прогениторных клеток T595, 1:400 Novocastra, Великобритания ЭСА - эпителиальный специфический антиген VU-1D9, 1:10 Novocastra, Великобритания ЭМА - эпителиальный мембранный антиген GF1.4, 1:100 Novocastra, Великобритания ЦКР18 - белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток DC10, 1:20 Dako, Дания * - данные не предоставлены фирмой-производителем, окрашивание осуществляли согласно рекомендациям фирмыпроизводителя. Окончание таблицы Антиген Клон, разведение Фирмапроизводитель ЦКР19 - белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток BA17, 1:20 Dako, Дания Bcl2 - антиапоптотический протеин, маркёр стволовых и прогениторных клеток 124, 1:30 Dako, Дания CD10 - FITC (маркер фибробластов, гранулоцитов, В-лимфоцитов, а также почечного эпителия) -* Sorbent CD14 - FITC (маркер макрофагов, нейтрофилов, дендритных клеток) -* Sorbent CD29 - APC (маркер лимфоцитов, моноцитов, а также один из маркеров МСК) MAR4 BD, США CD34 - Alexa 647 (маркер эндотелиальных клеток, стромальных клеток костного мозга) ICO115 SantaCruz, США CD45 - PE/Cy5 (маркер лейкоцитов, а также гематопоэтических стволовых клеток) HI30 BD, США CD54 (ICAM-1) - Alexa 647 (маркер эндотелиальных клеток, лимфоцитов, моноцитов) 15.2 SantaCruz, США CD56 (NCAM) - PE (маркер натуральных киллеров и цитотоксических лимфоцитов, кроме того обнаружен на некоторых популяциях МСК, выделенных из костного мозга и пульпы молочных зубов [10] -* Sorbent CD90 (Thy-1) - APC (маркер прогениторных клеток, один из маркеров МСК) 5E10 BD, США CD166 (ALCAM) - PE (маркер активированных Т-клеток, моноцитов, фибробластов, эпителиальных клеток, а также один из маркеров МСК) 3A6 BD, США Подтверждение экспрессии ЭМА и ЦКР18 было подтверждено методом иммуноблоттинга. Для этого в лунку геля наносили лизат клеток, полученных на 3, 5, 7 и 12 сут. культивирования. В качестве контроля при иммуноблоттинге использовали антитела к Р-актину. Визуализацию иммунного преципитата проводили с помощью набора для хемилюминесцентной детекции белка Amersham TMECLTM Prime Western Blotting Detection Reagent (GE HealthcareBio - Sciences AB). Детекцию люминесценции проводили на приборе ChemiDoc XRS+ System (Bio-Rad, Сингапур). Иммунофенотипирование клеток, выделенных из пульпы постоянных зубов человека. Иммунофенотип полученных клеток определяли с помощью метода проточной цитофлуориметрии с использованием конъюгированных с флуорохромами моноклональных антител к поверхностным антигенам клеток человека (см. табл.) как описано ранее [11]. Клетки с чашки Петри снимали с помощью 0,25% раствора трипсина-ЭДТА (Sigma, США). Отмывали один раз в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) в режиме центрифугирования 1400 об./мин, 5 мин, при комнатной температуре. Ресуспендировали осадок клеток в ФСБ, добавляли конъгированные с флуорохромами антитела и инкубировали 20 мин при комнатной температуре без доступа света. Далее клетки отмывали один раз в ФСБ, ресуспендировали осадок клеток в ФСБ. Анализ проводили на проточном цитометре Guava easyCyte 8HT (Millipore, США). результаты На 3 сутки мы наблюдали миграцию клеток из культивируемых кусочков пульпы зуба на периферию. Вся периферия вокруг эксплантата на 12 день была занята клетками веретенообразной формы (рис. 1). При проведении иммуноцитохимического окрашивания наблюдали в клетках экспрессию C-kit (рис. 2) и виментина (рис. 3) на всех сроках культивирования. Рис. 1. Культура клеток, полученных из пульпы постоянных зубов человека, 12 сут. после эксплантации. Ув. x10 Рис. 2. Культура клеток пульпы зуба (3 пассаж), иммуноцитохимическая реакция с антителами к c-kit. Докраска: гематоксилин. Ув. х20 Рис. 4. Культура клеток пульпы зуба (3 пассаж), иммуноцитохимическая реакция с антителами к ЭМА. Докраска: гематоксилин. Ув. х20 Рис. 3. Культура клеток пульпы зуба (3 пассаж), иммуноцитохимическая реакция с антителами к виментину. Докраска: гематоксилин. Ув. х20 5. Культура клеток пульпы зуба (3 пассаж), иммуноцитохимическая реакция с антителами к ЦКР19. Докраска: гематоксилин. Ув. х20 Примерно половина клеток иммуноцитохимически окрашивалась антителами к ЭМА на всех пассажах (рис. 4). Клетки 1 и 2 пассажа характеризовались стойкой экспрессией ЦКР18, однако количество окрашенных клеток с каждым последующим пассажем уменьшалось и к 5 пассажу окрашивались лишь единичные клетки. Подтверждение экспрессии ЭМА и ЦКР18 было проведено методом иммуноблоттинга. Клетки ранних пассажей не экспрессировали ЦКР19. Начиная с 3 пассажа, обнаруживались единичные ЦКР19 позитивные клетки, тогда как все клетки 5 пассажа экспрессировали ЦКР19 (рис. 5). Окрашивание клеток против ЯАПК на 3 и 5 пассажах происходило лишь в единичных клетках. Иммуноцитохимическое окрашивание с антителами против ЭСА, аГМА, десмина и Bcl-2 не выявило клеток, в которых присутствовали бы данные антигены. Подтверждение экспрессии ЭМА и ЦКР18 было проведено методом иммуноблоттинга (рис. 6). Методом проточной цитофлуориметрии установлено, что клетки, полученные нами из пульпы постоянных зубов человека, характеризуются следующим фенотипом: CD29+, CD90+, CD10+, CD54+, CD56+, CD166+ / CD14-, CD34-, CD45- (рис. 7). Рис. 6. Иммуноблоттинг. Контроль - антитела к в-актину CD56-PE 104 100 101 102 103 104 CD166-PE Интенсивность флуоресценции Рис. 7. Результат проточной цитофлюорометрии с определением антител CD10-FITC; CD29-APC; CD90-APC; CD54-Alexa 647; CD56-PE; CD166-PE; CD14-FITC; CD34-Alexa647; CD45-PE/Cy5; контроль - зеленые пики 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 CD34-Alexa647 CD45-PE/Cy5 обсуждение Пять различных типов клеток со свойствами стволовых клеток рассматриваются как потенциальные стволовые клетки пульпы зуба: 1) стволовые клетки, полученные из зубных зачатков; 2) стволовые клетки, полученные из пульпы молочных зубов; 3) стволовые клетки сверхкомлектных зубов; 4) стволовые клетки из апикального сосочка; 5) стволовые клетки, полученные из тканей периодонта. Все эти типы клеток способны к самоподдержанию, обладают хорошим пролиферативным потенциалом и при изменении условий культивирования могут дифференцироваться в различных направлениях. Стойкая экспрессия маркера стволовых клеток C-kit во всех пассажах является признаком того, что культивированные нами клетки обладают фенотипом стволовых и прогениторных клеток, и, следовательно, обладают пролиферативным потенциалом, могут быть использованы в тканевой инженерии и регене ративной медицине. C-kit - это рецептор, с которым связывается фактор стволовых клеток (stem cell factor, SCF). Их взаимодействие играет важную роль в пролиферации, дифференцировке и активации прогениторных клеток в различных биологических системах. Оба - и фактор, и его рецептор - были обнаружены в клетках пульпы, причём есть клетки, которые одновременно экспрессируют и лиганд, и рецептор [12]. При помощи проточной цитометрии и сортинга клеток группа итальянских исследователей под руководством G. Papaccio (1988) выделила из постоянных и молочных зубов популяцию c-kit+/CD34+/CD45- клеток [13]. Эти клетки при создании определенных условий in vitro дифференцируются в остеобласты, мышечные трубочки, жировые или эндотелиальные клетки [14-19]. По своим свойствам и фенотипу полученные из пульпы клетки были очень близки к ММСК, которые в настоящий момент с успехом получают из самых различных органов и тканей. На всех сроках нашего исследования мы наблюдали стойкое специфическое иммуноцитохимическое окрашивание полученных нами клеток из пульпы постоянных зубов человека к маркеру мезенхимальных клеток - виментину. Методом проточной цитофлюо-рометрии нами показано, что полученные клетки экспрессируют основные маркеры ММСК (CD29, CD56, CD90, CD166), кроме того, у полученных клеток отсутствует экспрессия маркеров не характерных для ММСК (CD14, CD34), а также маркера, характерного для гемопоэтических стволовых клеток (CD45) [20, 21]. При этом клетки оказались положительны в отношении маркеров, характерных для широкого круга клеток, в том числе для эпителиальных клеток (CD10, CD54). Более интересным на наш взгляд является то, что часть клеток, высеявшихся из пульпы зуба, на своей поверхности экспрессировали ЭМА, который, безусловно, может рассматриваться как маркер эпителиальных клеток, хотя экспрессия ЭМА описана для некоторых популяций лимфоцитов [21]. Дополнительными доказательствами того, что в ходе наших экспериментов мы получили из пульпы зуба именно эктомезенхимные клетки, являются наличие в культивированных клетках белков промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток цитокератинов 18 и 19. Недавно опубликованы данные о возможности образования предшественников одонтобластов из глиальных клеток, которые в составе нервов входят в пульпу зуба [22] и которые по своей природе являются, как и эктомезенхима, производными нервного гребня. благодарности Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров и субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. А.А. Ризванов поддержан грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых докторов наук МД-433.2013.4. Работа частично выполнена на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования и Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.

About the authors

I. I Sagitov

Kazan State Medical University

A. K Shafigullina

Kazan (Volga region) Federal University

G. T Saleeva

Kazan State Medical University

M. O Gomzikova

Kazan (Volga region) Federal University

AA. A Rizvanov

Kazan (Volga region) Federal University

A. P Kiassov

Kazan (Volga region) Federal University

References

Supplementary files