The study of phenotypic profile and osteogenic properties of gingival fibroblasts

Abstract

Full Text

Введение. Несмотря на значительный арсенал материалов для костной пластики и широкий диапазон методов реконструкции кости, восстановление утраченных костных структур челюстей, по-прежнему, представляет собой сложно решаемую проблему хирургической стоматологии и дентальной имплантологии. В этой связи для активации репаративного остеогистогенеза в зоне дефекта рассматривается возможность реализации терапевтической стратегии, в основе которой лежит применение мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) - недифференцированных или малодифференцированных предшественников, дающих начало различным типам соединительной ткани. Долгие годы в качестве основного источника ММСК рассматривали костный мозг. Между тем, для стоматолога наиболее удобным ресурсом для получения клеточного материала являются ткани полости рта. В связи с этим нами предпринята попытка поиска альтернативного источника с целью получения культур клеток с остеогенными потенциями для дальнейшего их эффективного использования в регенеративной хирургии костной ткани. Имеющиеся на сегодняшний день экспериментальные данные позволяют предположить, что адекватной заменой этим клеткам могут быть фибробластоподобные клетки, выделенные из соединительной ткани десны. В культуре данные клетки активно продуцируют проколлаген, проэластин, гликоза-миногликаны, факторы роста и другие компоненты межклеточного матрикса. При использовании in vivo они не вступают в конфликт с собственной иммунной системой, не вызывают аллергических и других побочных реакций. Цель работы: исследовать возможность использования фибробластов десны (Фд) для восстановления утраченных костных структур челюстей. Материал и методы. Фибробласты выделяли из биоптатов десны (2-3 мм в диаметре), у 10 здоровых добровольцев по стандартной методике. Клональный анализ проводили, используя клетки 1 пассажа. Эффективность колониеобразования фибробластов (ЭКОф) определяли после стандартной окраски, за колонию принимали клон клеток, содержащий не менее 50 клеток. Иммунофлуоресцентный анализ проводили, используя первичные и вторичные моноклональные антитела, меченные родамином. Поверхностные маркеры (CD) определяли посредством цитофлуориметра FACS Canto™ II c программным обеспечением «FACSDiva™» (Becton Dickinson, США). Индукцию остеогенной дифференцировки фибробластов осуществляли на среде a-Mem, 10% фетальная сыворотка коров (ФСК) с добавлением 10 нМ дексаметазона, 10 мМ р-глицерофосфата и 0,2 мМ аскорбиновой кислоты. В качестве критериев остеогенной дифференцировки использовали образующиеся кальцификаты и экспрессию остеокальцина. Результаты. Анализ иммунофенотипа фибробластоподобных клеток, выделенных из десны человека, показал отсутствие у них гемопоэтических (CD34, CD45), эпителиальных (панцитокератины 14-16, 19) и наличие мезенхимных (CD73, CD90, CD105) поверхностных маркеров. Клетки экспрессировали также внутриклеточные маркеры фибробластов - коллагены I, III типа, эластин и виментин. Эффективность колониеобразования фибробластов (ЭКО-ф) десны составила в среднем 57±2%. Выявлено, что Фд образуют колонии, отличающиеся между собой по размерам и морфологии составляющих их клеток, которые по аналогии с колониями фибробластов кожи обозначены как плотные, диффузные и смешанные. При этом доля плотных колоний в 5-10 раз превышает доли смешанных и диффузных колоний. Остеогенная дифференцировка фибробластов десны. При культивировании Фд в условиях, способствующих остеогенной дифференцировке, во всех исследуемых культурах отмечено изменение морфологии клеток с классической веретеновидной формы на кубоидальную - характерную для остеобластов. Гистохимический анализ с использованием окраски Alizarin Red S продемонстрировал наличие кальцификатов во внеклеточном матриксе. При этом выявлено, что все исследуемые культуры фибробластов десны, без исключения, демонстрируют способность к дифференцировке в остеогенном направлении. Случаев спонтанной остеогенной дифференцировки фибробластов десны в контрольных культурах (состав культуральной среды - a-Mem, 10% ФСК) не отмечалось. Проведенный иммуногистохимический анализ исследуемых культур фибробластов десны выявил экспрессию ими остеокальцина. Заключение. Полученные нами результаты характеризуют фибробласты десны, как однородную культуру, состоящую из мезенхимных клеток с высоким клоногенным и остеогенным потенциалами и позволяет рассматривать данные клетки в качестве перспективного компонента для создания тканеинженерных конструкций с целью восполнения утраченных скелетных тканей в челюстно-лицевой хирургии.