The assessment of morphofunctional properties of skin fibroblasts after ionizing irradiation

Abstract

Full Text

Эффективное лечение местных лучевых поражений (МЛП) является одной из наиболее актуальных и сложных проблем современной радиационной медицины, в то же время тактика и стратегия лечения этих патологий до настоящего времени остаются не разработанными в полной мере. Моделирование последствий местного радиационного воздействия in vitro и изучение клеточных механизмов регенеративных процессов в зоне повреждения, с нашей точки зрения, могут быть полезными в разработке инновационных методов и подходов, способствующих оптимизации лечения пациентов с МЛП. Цель исследования: провести сравнительный анализ морфофункциональных свойств фибробластов, выделенных из ex vivo облученных и необлученных образцов кожи. Материал и методы. Биоптаты кожи из абдоминальной области от 25 пациентов в возрасте 30- 70 лет получали в ходе проведения хирургических операций при наличии письменного информированного согласия пациентов. Из биоптатов посредством стилета для биопсии (Epitheasy EPT2000-01, d = 6,5 mm) получали стандартизованные по размеру образцы (из каждого биоптата 7 образцов: один - для контроля, 6 - для эксперимента). Полученные образцы подвергали облучению различными дозами ионизирующего излучения (5, 10, 15, 20, 25 и 30 Гр). Облучение биоматериала проводили на рентгеновской установке Radgil (GILARDONI S.p.A) согласно стандартам, разработанным научными клиническими центрами РАМН и Министерства Здравоохранения России. Выделение клеток как из облученных, так и необлученных образцов кожи проводили путем ферментативной обработки по стандартной методике. Полученные клетки культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (StemCell Technology, США) с добавлением 2 мМ L-глутамина (StemCell Technology, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (StemCell Technology, США) и 10% FBS (Biological Industries, Израиль). Смену среды производили каждые 3-4 сут. Для оценки эффективности колониеобразования фибробласты первого пассажа высевали с клональной плотностью 3-4 клетки на см2 поверхности чашек Петри диаметром 60 мм и культивировали в течение 14 сут. Эффективность колониеобразования (ЭКОф) рассчитывали по формуле: ЭКОф = 1\1кол/1\1кл*100°/о, где \1кол - количество образовавшихся колоний; \1кл - количество эксплантированых клеток. При подсчете учитывались колонии, содержащие не менее 50 клеток. Определение времени удвоения клеточной популяции (T2). Фибробласты высевали с плотностью 104/см2 и культивировали до формирования 90/ монослоя. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Время удвоения популяции оценивали по формуле: T2 = Тк*1п(2)Дп(1\1к/1\10), где N0 - число клеток, эксплантированных в начале культивирования; Тк - длительность культивирования одного пассажа в часах; \к - конечное число клеток через Тк. Оценку секреторной активности клеток в культуральной среде проводили на ИФА-наборах R&D Systems (США) по методике производителя. Результаты. Фибробласты, полученные из облученных образцов кожи, характеризовались наличием множества ядер и большими размерами по сравнению с контролем (фибробластами, полученными из необлученных образцов кожи). При изучении ЭКОф выявлено, что в культурах фибробластов с увеличением дозы облучения наблюдалось значительное снижение доли плотных. Также в культурах фибробластов, полученных из облученных образцов кожи, отмечается снижение времени удвоения клеточной популяции и снижение уровней экспрессии клетками VEGF, интерлейкинов-4,6,8,10 и TGF-p. По аналогичному алгоритму нами также проанализированы 20 образцов кожи от лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию во время проживания на радиоактивно-загрязненных территориях Челябинской области. Результаты исследований продемонстрировали сходную с экспериментальной работой картину. Выводы. Проведенные исследования выявили прямую зависимость между снижением регенераторного потенциала фибробластов и увеличением дозы облучения как острого, так и хронического. Полученные данные можно рассматривать в качестве перспективной базы для разработки принципиально нового способа биологической дозиметрии, который может быть использован в оптимизации подходов к лечению пациентов с МЛП.