Possibilities of differentiation of native and in vivo activated hepatic stellate cells transplanted into rats after partial hepatectomy or liver damage by carbon tetrachloride

Full Text

Актуальность. Звёздчатые клетки печени (ЗКП) продуцируют важные морфогенетические цитокины (фактор роста гепатоцитов, фактор стволовых клеток и т.д.) и экспрессируют целый ряд маркёров стволовых клеток, таких как Okt 4, Bcl-2, C-kit и др. Более того, ЗКП и гепатоциты располагаются в непосредственном контакте друг с другом, а в период эмбрионального гистогенеза печени крысы и человека эти клетки обладают общими фенотипическими признаками, экспрессируя десмин (маркёр звездчатых клеток печени) и цитокератины 18 и 19 (маркёры гепатобластов и гепатоцитов), что позволило выдвинуть теорию о возможности мезенхимальноэпителиальной трансдифференцировки данных клеток и о существовании общего для обеих популяций клеточного предшественника. В наших ранних работах мы установили возможность дифференцировки ЗКП в клетки с фенотипом гепатоцитов в ходе пренатального онтогенеза человека и при культивировании изолированной популяции ЗКП крысы. Целью настоящего исследования стало изучение возможности гепатоцитарной дифференцировки ЗКП после их трансплантации крысам с повреждениями печени различной природы. Материал и методы. ЗКП были изолированы из печени интактных крыс и крыс, получивших за двое суток до выделения клеток однократную внутривенную инъекцию нитрата свинца (100 мМоль/ кг веса животного) методом проназно-коллаге-назной перфузии с последующим разделением на градиенте плотности гистоденза. Введение нитрата свинца в указанной дозе вызывает незначительное повреждение печени за счёт усиления перикисного окисления липидов, сопровождающееся неполной активацией ЗКП (усиление экспрессии десмина и пролиферация без трансдифференцировки в миофибробласты). Изолированные ЗКП были трансфецированы геном зелёного флуоресцентный белка (GFP) и трансплантированы в воротную вену крысам с повреждением печени в дозе 3х10в клеток. Для повреждения печени использовали 2 модели: операцию частичной ге-патэктомии (трансплантация ЗКП интраоперационно) и острое токсическое повреждение четыреххлористым углеродом (трансплантация ЗКП через сутки после введения четырёххлористого углерода (ЧХУ)). Контрольным крысам вводили соответствующий объём растворителя. Через 1, 2, 5, 7, 14 сут. животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом, печень фиксировали и заливали в парафин по стандартной методике. Срезы окрашивали иммуногистохимически с антителами к GFP, десмину, ядерному антигену пролиферирующих клеток PCNA, альфа-гладкомышечному актину (a-ГМА), цитокератинам. Результаты. Во всех экспериментальных группах мы выявили мелкие округлые GFP+ клетки в перипортальных зонах и GFP+ клетки, имеющие форму и размеры гепатоцитов. Наибольшее число GFP+ гепатоцитов отмечено в печени крыс через 1-2 сут. после частичной гепатэктомии и трансплантации клеток (5-7 клеток/поле зрения). После трансплантации in vivo активированных ЗКП крысам с частичной гепатэктомией число GFP+ гепатоцитов было существенно ниже. В случае повреждения печени ЧХУ лишь единичные нативные ЗКП после трансплантации приобретали фенотип гепатоцитов. Однако на этой модели трансплантация in vivo активированных ЗКП приводила к появлению большего числа GFP+ гепатоцитов в паренхиме печени: первые позитивные клетки в фенотипом гепатоцитов отмечены через сутки после трансплантации, и их число достигало максимума через 5 сут. эксперимента. Вероятно, таким образом, важным фактором, определяющим возможность и динамику гепатоцитар-ной дифференцировки ЗКП после трансплантации, является характер повреждения органа. Во всех сериях экспериментов ни на одном из экспериментальных сроков не выявлено a-ГМА-позитивных миофибробластов в паренхиме, что указывает на низкий риск развития фиброза после трансплантации даже активированных ЗКП. Позитивное окрашивание наблюдали только в гладкомышечных клетках кровеносных сосудов. Уровень и динамика пролиферативной активности клеток печени после повреждения в опытных и контрольных группах значимо не отличались. В отличие от результатов трансплантации мононуклеаров пуповинной крови трансплантация ЗКП не приводит к появлению у опытных животных GFP+ клеток в эпителии внутрипечёночных желчных протоков и СЕР+/цитокератин 19+ клеток. Таким образом, ЗКП имеют меньший дифференцировочный потенциал (гепатоциты) по сравнению с кроветворными столовыми клетками (гепатоциты, холангиоциты). Выводы. Звёздчатые клетки печени способны дифференцироваться в клетки с фенотипом гепатоцитов после трансплантации крысам с повреждением печени без риска развития фиброза. При этом в случае частичной гепатэктомии более эффективным с точки зрения репопуляции гепатоцитов является введение нативных ЗКП, а при токсическом повреждении четырёххлористым углеродом - активированных in vivo ЗКП. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 12-04-97088-р_поволжье_а).

About the authors

A. A Gumerova

A. K Shafigullina

G. R Burganova

A. A Titova

M. O Mavlikeev

A. R Muchamedov

E. I Sharipova

M. A Titova

M. S Kaligin

I. M Gazizov

A. P Kiassov

References

Supplementary files