Detection of mycoplasma contamination in mammalian cell cultures

Abstract

Full Text

Основными контаминантами клеточных культур являются семь видов микоплазм. В основной массе это виды, инфицирующие человека (M. orale, M. fermentans, M. hominis, M. salivarium, Acholeplasma laidlawii), а также крупный рогатый скот (M. arginini) и свиней (M. hyorhinis), что указывает на основные источники загрязнения - персонал лаборатории, сыворотка крови или реагенты. Зачастую научные коллективы, работающие с культурами клеток, недооценивают опасность микоплазменной контаминации и не осуществляют периодическую проверку. Коварность микоплазм заключается в способности расти в культуре эукариотических клеток, оставаясь при этом незамеченными, распространяясь на другие культуры, реагенты. Опасность заражения культуры клеток микоплазмами заключается в изменении метаболизма и других биологических свойств эукариотических клеток. При высокой степени обсемененности микоплазмами наблюдается ингибирование роста клеточной культуры, снижение жизнеспособности, повышение количества мутаций. Изменение свойств эукариотических клеток вследствие микоплазменной контаминации, в свою очередь, грозит ложной интерпретацией результатов эксперимента. Цель работы: протестировать вновь поступившие из других лабораторий культуры клеток млекопитающих на наличие микоплазменной контаминации и идентифицировать обнаруженные микроорганизмы. Материал и методы. Культуральную среду и (или) суспензию культуры клеток центрифугировали в режиме: 10 мин., 16 тыс. g при комнатной температуре. Осадок использовали для выделения общей ДНК методом фенол-хлороформной экстракции. Выделенную ДНК использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР со специфичными праймерами к участку гена 16S рРНК микоплазм. Полученные ампликоны секве-нировали с целью идентификации вида микоплазмы. Результаты. Всего было протестировано 42 образца из 27 видов культур клеток, поступивших в лабораторию в разные периоды времени. Из 42 образцов 32 оказались контаминированы - таким образом, процент контаминации составил 76,19%. Согласно результатам секвенирования с идентичностью 97-100% и покрытием 93-100% контами-нантами протестированных клеточных культур являются два вида микоплазм M. arginini и M. hyorhinis. Поскольку используемая в лаборатории среда, сыворотка крови, трипсин не дали положительных ПЦР-сигналов, можно предположить, что клеточные культуры, привнесенные из других лабораторий, оказались исходно контаминированы. Выводы. В настоящее время фирмы-поставщики сыворотки крови и реагентов осуществляют строгий контроль чистоты своего продукта. Поэтому основными источниками микоплазменной контаминации являются персонал лаборатории или, что подтвердило наше исследование, широко распространенная практика обмена клеточными линиями без строгого контроля микоплазменной контаминации. Проведенное исследование еще раз подчеркивает важность тестирования клеточных линий, передаваемых из одной лаборатории в другую, а также постоянное тестирование культур клеток в лаборатории на наличие контаминации.