Neural crest - derived multipotent stem/progenitor cells in culture in vitro: self-renewal, clonal multipotency and spherogenesis

Abstract

Full Text

Бульбарный регион волосяного фолликула взрослых млекопитающих содержит мультипотентные стволовые клетки - производные нервного гребня (МСК-ПНГ) (M. Sieber-Blum, 2004). Используя метод эксплантатов и селективные условия культивирования из бульбарного региона волосяного фолликула можно получить «чистую» культуру клеток - производных нервного гребня - для изучения их биологических свойств. Целью данной работы являлось изучение биологических свойств МСК-ПНГ из бульбарного региона волосяного фолликула взрослых млекопитающих на клональном уровне. Материал и методы. Культуры МСК-ПНГ получали из бульбарного региона волосяного фолликула вибрисс взрослых мышей линии FVB (самцы возрастом 4-6 мес.) по методу M. Sieber-Blum в собственной модификации. Клетки культивировали на коллагене I типа в среде DMEM:F12 c 10% фетальной сывороткой коров, 2 нг/мл bFGF, 2 мМ глутамина, 1% питательной добавки В27 и 1% витаминов MEM в мультигазовом инкубаторе при 37°С, насыщающей влажности, 5% СО2 и 5% О2. Способность клеток к росту в условиях клональной плотности была оценена в КОЕф-тесте путем засева 100 клеток в чашку Петри 100 мм и культивирования в течение 14 дней. Для дальнейших экспериментов были отобраны колонии, содержащие более 100 клеток (в среднем ~500 клеток) и пересеяны при помощи клонирующих цилиндров. Эксперименты по направленной дифференцировке были выполнены на клональных культурах (n = 9), полученных от 3 различных доноров. Направленная дифференциация в адипо- и остеогенном направлении была выполнена по общепринятым протоколам (D. Prockop, 2004). Для нейрональной дифференциации МСК-ПНГ были культивированы в среде Neronal Base Medium P с 10% экстракта мышиного головного мозга, 1% питательной добавки В27, 2% питательной добавки NeuroMix, 2 мкМ ретиноевой к-ты, 5 нг/мл bFGF и 20 нг/мл EGF на поли-Ь-лизине. Для направленной дифференциации в глиальные клетки среда вышеуказанного состава была дополнена 100 нМ изопротеренола, а в качестве субстрата использовался коллаген I типа. Дифференциация была оценена при помощи цитохимического окрашивания красителями Alizarin Red S (остеогенная), Oil Red O (адипогенная), и иммунофлюресцентным окрашиванием с анти-piII-тубулин (для нейронов, 1:500) и анти-S-IOO (для Шванновских клеток, 1:500) антителами с детекцией вторичными FITC-конъюгированными антителами (все - Abcam, Великобритания). Для сферогенеза МСК-ПНГ культивировались в бессывороточной среде следующего состава: DMEM:F12, 2% питательной добавки B27, 40 нг/мл bFGF и 40 нг/мл EGF. Числовые данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±s). Эксперименты выполнены с соблюдением принципов биоэтики и норм биологической безопасности, что подтверждено заключением комиссии по биоэтике ГУ «Институт генетической и регенеративной медицины НАМНУ». Результаты. Тест на КОЕф показал способность фибробластоидных клеток из бульбарного региона волосяного фолликула к росту в условиях клональной плотности. Эффективность колониеобразования составила 72,58±12.35%. При этом наблюдалось формирование колоний 3-х типов (по числу и морфологии клеток): колонии I типа (13,86±2,74% от общего числа колоний) - 8-10 крупных клеток с морфологическими признаками терминальной дифференциации; колонии II типа (31,68±8,35%) - 30-70 клеток различного размера и морфологии; колонии III типа (54,46±7,58%) - более 100 (от 500 до 1000) клеток, с преобладанием клеток небольшого размера без морфологических признаков дифференциации. При субклонировании колонии III типа (n = 15; от 3 различных животных) наблюдалось формирование новых колоний всех трех типов: I типа - 28,25±2,78%; II типа - 40,9±7,04%; III типа - 31,88±4,36% от общего числа новообразованных колоний. Таким образом, КОЕф-тест показал гетерогенность фибробластоидных клеток из бульбарного региона по клоногенному потенциалу и выявил способность части клеток к самообновлению. В дальнейших экспериментах, выполненных на клональных культурах (n = 9), полученных путем субклонирования колоний III типа (n = 9, от 3-х различных животных), была показана их способность к формированию флотирующих сфер в бессывороточных условиях культивирования и к направленной дифференциации в адипоциты, остеобласты, нейроны и Шванновские клетки. Таким образом, в ходе работы установлено, что бульбарный регион волосяного фолликула взрослых млекопитающих содержит МСК-ПНГ, обладающие способностью к самообновлению, направленной мультилинейной дифференциации и сферогенезу на клональном уровне.