Experimental partial and complete transection spinal cord and its bioengineering reconstruction

Abstract

Full Text

Цель исследования: разработка трехмерной биополимерной матрицы для культивирования и прямой трансплантации эмбриональных стволовых клеток мыши, трансформированных в нейрональные клетки, в частичный или полный дефект спинного мозга с целью его реконструкции при экспериментальной осложненной позвоночно-спинальной травме. Материал и методы. Для создания нейрональных матриц был использован базовый полиионный комплекс, состоящий из нано-микроструктуриро-ванного аскорбата хитозана с молекулярной массой 695 kDa и степенью дезацетилирования 98%, при содержании на 1 г сухого хитозана аскорбиновой кислоты 1,8 г, включающий солевые анионные формы хондроитинсерной (Sigma, США) (20 мг/г), гиа-луроновой (Sigma, США) (10 мг/г) кислот и гепарина (5 мг/г) (Россия), сывороточного фактора роста крупного рогатого скота «адгелон» (110 мкг/г) (Россия). Культивирование на коллаген-хитозановых матрицах ЭСК мыши в кондиционированной среде от мышиных эмбриональных нейрональных клеток при добавлении в среду нейрональной добавки N2 (Sigma, США) или B27 (Sigma, США), а также ретиноевой кислоты (Sigma, США) приводит к нейрональной дифференцировке. В перечень манипуляций перед трансплантацией в спинной мозг крысам популяции Вистар входило: культивирование и дифференцировка эмбриональных стволовых клеток мыши и их маркерный анализ, получение кондиционированной среды от культивированных эмбриональных нейрональных клеток, иммуноцитохимический контроль нейрональной дифференцировки стволовых клеток, экспериментальная спинальная травма у крыс (частичный и полный разрыв спинного мозга), перенос клеточной массы на матрицы и их культивирование, трансплантация в дефект спинного мозга различных по составу клеточных матриц, послеоперационный уход, динамический неврологический контроль, гистологический анализ срезов спинного мозга в различные сроки после трансплантации, маркерный анализ диспергатов и срезов спинного мозга, включая анализ ядерных и мембранных специализированных молекул, нейротрансмиттеров. Результаты и обсуждение. Предложенные режимы культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши после соответствующей подготовки биодеградируемых матриц позволяют повысить качество и стабильность культивирования, исключить на конечном этапе получения клеточной матрицы обработку клеток ферментами в процессе пассирования при смене питательной среды, повысить прикрепление клеток к поверхности матрицы, предупредить их потерю при пересеве на питательные среды благодаря присутствию в ней хитозанового биополимера, обеспечить получение клеточной матрицы, пригодной для прямой трансплантации. Добавление в базовый полиионный коллаген-хитозановый комплекс кондиционированной среды от нейрональных клеток эмбриона мыши или кондиционированной среды от культивируемых предшественников нейрональных клеток мыши, или компонента N2 и ретиноевой кислоты приводит к нейрональной дифференцировке ЭСК мыши с экспрессией нейрофиламентов, GFAP и нестина, моделирует их внешнюю морфологию. Анализ неврологического дефицита у крыс после полной транссекции спинного мозга показывает, что трансплантация бесклеточной коллаген-хитозановой матрицы в диастаз спинного мозга на уровне IX грудного позвонка приводит к заметному сокращению объема нарушений, восстанавливая функции тазовых органов в полном объеме, а также обеспечивает 5-6 уровни восстановления моторных и сенсорных функций спинного мозга в течение 20 нед. наблюдения. Имплантация в диастаз спинного мозга коллаген-хитозановой подложки со 100 тыс. предшественников нейрональных клеток мыши приводит к практическому полному устранению нейродефицита, достигая в течение 20 нед. 20-го уровня восстановления. Исследование опытных образцов спинного мозга показало, что со стороны трансплантата регистрируется спрутинг клеток, продуцирующих GFP, в зону центрального конца материнского спинного мозга. Трансляция ядросодержащих клеток сопровождается экспрессией нейромедиаторов GABA, acetylcholine and serotonin в различные сроки после операции. Детальный серийный анализ срезов собственно клеточного трансплантата в спинном мозге указывает на богатое содержание жизнеспособных нейронов, продуцирующих GFP и одновременно экспрессирующих нейромедиаторы. Трансплантированная клеточная масса помимо пришедших материнских нейрональных клеток занимает весь объем коллаген-хитозановой подложки. В каудальной части спинного мозга животных опытной группы регистрируется сниженное число ядросодержащих клеток с экспрессией и без экспрессии нейромедиаторов. Изучение серийных срезов ниже коллаген-хитоза-нового клеточного трансплантата (хвостовой отдел спинного мозга) выявляет слабый феномен спрутин-га GFP-клеток. Исследования выполнены при поддержке грантов государственного фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (проект №6746р/9167 от 10.04.2009 г. и проект № 8775 р/13993 от 11.01.2011 г., проект № 10494 r/16892 от 06.08.2012).