Development of «activated» osteoplastic material containing plasmid DNA with vegf-a165 gene

Abstract

Full Text

Введение. Эффективное реконструктивное лечение при патологии костей скелета, зачастую, требует применения остеопластических материалов. В ряде случаев, когда необходима лишь оптимизация естественного репаративного процесса, достаточно использования простых (ординарных) материалов - без биологической активности, - которые характеризуются лишь остеокондуктивными свойствами. Однако при необходимости замещения протяженных и (или) объемных костных дефектов, когда активность естественных остеоиндуцирующих факторов снижена («остеогенная недостаточность»), требуется индукция репаративного процесса и поддержание его на высоком уровне до полного восстановления целостности кости. Такое влияние могут оказать лишь активированные (оптимизированные) остеопластические материалы, наделенные остеоиндуктивными свойствами и (или) остеогенностью за счет включения в их состав биологически активных компонентов. К настоящему времени в соответствии с природой биологически активного компонента сформировалось три основных тренда в создании оптимизированных остеопластических материалов: постгеномный, клеточный и генный. В виду ряда недостатков первых двух направлений, мы сосредоточили свои усилия на разработке ген-активированного костного графта (ГАКГ). Материал и методы. В связи с ключевой ролью ангиогенеза в обеспечении репаративного остеогенеза в качестве биологически активного компонента разрабатываемого материала мы выбрали плазмид-ные ДНК с геном, кодирующим VEGF-A165, - действующее вещество лекарственного препарата «Не-оваскулген» (Институт Стволовых Клеток Человека), обладающего выраженной ангиогенной активностью. Исследование включало два основных этапа: лабораторный и эксперимент in vivo. В ходе первого из различных групп ординарных остеопластических материалов отбирали два варианта с максимальной «вместимостью» для плазмидных ДНК. С этой целью после отмывки материалов в PBS выполняли их совмещение с растворами генных конструкций в концентрации 1 мкг/мкл в течение 10 ч, затем удаляли несорбированные плазмидные ДНК промыванием и элюировали связавшиеся с носителями генные конструкции, после чего определяли количество нуклеиновых кислот с помощью флуоресцентной спектрофотометрии. В результате, для создания ГАКГ были использованы синтетический композитный материал из коллагена и гидроксиапатита (№1), а также ксеногенный депротеинизированный костный матрикс (№2). Полученные варианты ГАКГ инкубировали с культурой ММСК с определением продукции белка VEGF на 1, 3 и 5 сут. посредством ИФА. В ходе второго этапа исследования разработанные ГАКГ №1 и №2 имплантировали в дефекты (диаметр 9-10 мм) правых теменных костей кроликов (экспериментальные группы 1 и 2). Аналогичные краниальные дефекты с левой стороны были использованы в качестве контроля - для имплантации соответствующих носителей без плазмидных ДНК (контрольные группы 1 и 2). В ряде случаев для создания ГАКГ использовали двухкассетные плазмидные ДНК с генами vegf и gfp, что было необходимо для последующей детекции экспрессии генных конструкций in vivo. Результаты эксперимента оценивали через 15, 30, 35, 60, 90 и 120 сут. гистологическими и рентгенологическими методами. Результаты и обсуждение. При инкубировании ГАКГ с культурой ММСК было выявлено значительное повышение уровня VEGF в культуральной среде, по сравнению с эндогенной продукцией, что подтвердило реализацию трансфекции in vitro. Через 15 сут. после имплантации с помощью иммуногистохимической реакции с антителами к GFP была выявлена экспрессия плазмидных ДНК клетками регенерата, а с антителами к a-SMA - большее количество сосудов, по сравнению с контролем, что является доказательством высвобождения генных конструкций из структуры носителя, трансфекции in vivo с продукцией биологически активного терапевтического белка. По данным КТ, на первом контрольном сроке существенной разницы между экспериментальной и контрольной группами 1 выявлено не было: дефекты сохранялись с первоначальными размерами, четкими границами, регенерат имел низкую плотность. Однако уже с 30 сут. после имплантации ГАКГ №1 размеры дефектов уменьшались более существенно (на 1-3 мм), границы дефектов становились менее четкими, а регенерат более плотным, чем при использовании носителя без генных конструкций. В итоге, к 120 сут. эксперимента в случае применения ГАКГ №1 наблюдалась практически полное восстановление целостности теменной кости, в то время как в контроле дефект сохранялся (диаметром 5-6 мм). При оценке результатов в группах 2 на ранних сроках (до 60 сут.) КТ оказалась малоинформативной в связи с высокой рентгенконтрастностью имплантированного материала (носителя из ксеногенного депротеинизированного костного матрикса). Однако и через 90, и через 120 сут. более полная консолидация наблюдалось только в случае ГАКГ 2, в отличие от контроля. Результаты рентгенологического исследования коррелировали с данными гистологического анализа. Больший объем костного регенерата, представленного на ранних сроках (15-60 сут.) ретикуло-фиброзной, а на поздних (90, 120) - пластинчатой костной тканью, определялся в экспериментальных группах 1 и 2. При этом, источниками репаративного остеогенеза являлись не только опилы теменных костей, но и фрагменты ген-активированных материалов, поскольку большинство из них, даже находящихся в центральной части дефекта, выполненного реактивно измененной рыхлой волокнистой соединительной тканью, были окружены новообразованной костной тканью. Такой эффект является прямым подтверждением остеоиндукции материала. В контроле же костный регенерат исходил лишь с периферии. Выводы. Таким образом, нами были разработаны два варианта ген-активированных остеопластических материалов, способных обеспечить более выраженный репаративный остеогенез даже в случае костных дефектов «критического» размера за счет индукции ангиогенеза.