Nestin gene expression in stromal precursor cells from the human bone marrow

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Успешное функционирование стволовых клеток крови в течение всей жизни организма во многом обусловлено кроветворным микроокружением костного мозга (КМ). Оно состоит из клеток разнообразных типов, чаще всего некроветворного происхождения, а также растворимых регуляторных факторов и внеклеточного матрикса. Большую часть кроветворного микроокружения составляют стромальные клетки — потомки мезенхимных стволовых клеток (МСК). В настоящее время экспериментально иерархия стромальных предшественников охарактеризована скудно. В экспериментах in vitro выделяют мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) [1] и колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕф) [2]. До сих пор не найдено уникального маркёра МСК или сочетания поверхностных антигенов, необходимых и достаточных для выделения чистой популяции этих самых ранних стромальных предшественников. Показано, что экспрессия гена нестина (NES), изначально выявленная в нейральных предшественниках [3], характерна и для МСК [4]. Часто экспрессия этого гена используется в качестве маркёра стволовых клеток в различных тканях [5–7], в том числе и МСК [8, 9]. Показана экспрессия нестина и в некоторых опухолевых клетках [10].

Цель работы — оценить уровень экспрессии гена NES в мультипотентных мезенхимных стромальных клетках и их потомках — колониеобразующих единицах фибробластов, выделенных из костного мозга здоровых доноров, а также выяснить, как изменяется этот показатель при переходе от стромальных бипотентных клеток-предшественниц, способных к остеогенной и адипогенной дифференцировкам, к монопотентным клеткам-предшественницам, способным осуществлять дифференцировку только в одну из указанных линий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Аликвоты КМ получали от доноров гемопоэтических стволовых клеток в момент плановой эксфузии КМ в отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга и гемопоэтических стволовых клеток Национального медицинского исследовательского центра гематологии (Москва, Россия). Все доноры подписали информированное согласие на участие в исследовании. Из КМ 19 доноров (11 мужчин, 8 женщин, средний возраст — 29,5±2,7 года) получали ММСК и КОЕф по стандартным методикам.

Для получения культуры ММСК 3×10⁶ мононуклеаров КМ помещали в культуральный флакон T25 и инкубировали при 37 °С и 5% СО₂ в стандартной культуральной среде αМЕМ (ICN Holding, США), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (HyClone, США), 2 мM L-глутамина (ICN Holding, США), 100 ед./мл пенициллина (ОАО «Синтез», Россия) и 50 мг/мл стрептомицина (ООО «БиоФармГарант», Россия). Культуральную среду меняли дважды в неделю. По достижении конфлюентности клетки трипсинизировали, подсчитывали и рассаживали из расчёта 10⁵ клеток на флакон Т25. Иммунофенотип и дифференцировочный потенциал ММСК, полученных по данному протоколу, соответствуют международным критериям [11], что было опубликовано нами ранее [12–14]. ММСК имели следующий иммунофенотип: CD105⁺CD73⁺CD90⁺CD45^–CD34^–CD14^–CD19^–HLA^–DR^–. Из ММСК на 1-м пассаже и КОЕф выделяли РНК по адаптированному протоколу [15].

Для получения культуры КОЕф 10⁶ мононуклеаров КМ помещали в культуральный флакон T25 и инкубировали при 37 °С и 5% СО₂ в течение 14 дней в стандартной культуральной среде αМЕМ (ICN Holding, США), содержащей 20% ЭТС (HyClone, США), 2 мM L-глутамина (ICN Holding, США), 100 ед./мл пенициллина (ОАО «Синтез», Россия) и 50 мг/мл стрептомицина (ООО «БиоФармГарант», Россия). Одновременно из тех же образцов КМ получали индивидуальные клоны КОЕф. В среднем из каждого образца донорского КМ было выделено 16±3 клона (от 1 до 50, медиана — 15). Для этого по 15 000 клеток КМ высаживали в лунки 96-луночной платы в среде αМЕМ с 20% ЭТС и культивировали в СО₂-инкубаторе при 37 ^оС и 5% СО₂. Клетки из лунок, где был выявлен рост только одного клона, по достижении конфлюентности пересаживали в ячейки 6-луночной платы в среде αМЕМ с 10% ЭТС. Затем конфлюентную ячейку рассаживали на три ячейки и через 2–3 дня в две из них добавляли стандартные смеси индукторов костной и жировой дифференцировок. В третьей ячейке контрольные клетки культивировали в стандартной среде.

Остеогенную дифференцировку индуцировали в стандартной среде для культивирования клеток, содержащей 0,1 мкM дексаметазона, 0,15 мM 2-фосфата аскорбиновой кислоты тринатриевой соли и 3 мM NaH₂PO₄.

Для индукции адипогенной дифференцировки использовали стандартную среду для культивирования, содержащую 1 мкM дексаметазона, 60 мкM индометацина и 5 мкг/мл инсулина.

Через 14 дней из клеток выделяли РНК. Ответ на индукторы дифференцировки определяли по изменению относительного уровня экспрессии (ОУЭ) маркёрных генов (ALPL и PTHR для остеогенной и FABP4 и PPARG — для адипогенной дифференцировки). ОУЭ маркёрных генов и гена NES анализировали при помощи ПЦР в режиме реального времени в модификации TaqMan. Последовательности праймеров и флуоресцентных проб были подобраны авторами и доступны по запросу. По ответу на индукторы костной и/или жировой дифференцировки для каждого клона делали вывод, к каким дифференцировкам данный конкретный клон способен. Затем в контрольных клетках, культивировавшихся без индукторов, анализировали ОУЭ гена NES. По этому протоколу проанализировано 296 индивидуальных клонов КОЕф, полученных из КМ здоровых доноров.

Статистическая обработка. Данные в тексте представлены в виде «среднее ± стандартная ошибка среднего». При анализе данных использовали U-критерий Манна–Уитни, статистически значимыми считали различия при p <0,05. Анализ данных выполняли на онлайн-ресурсе https://www.socscistatistics.com и в программе Microsoft Excel. При помощи онлайн-ресурса http://shiny.chemgrid.org/boxplotr/ сделано графическое представление данных в виде диаграмм размаха («ящиков с усами») по Тьюки. На диаграммах центральная горизонтальная линия обозначает медиану, границы фигуры — 25-й и 75-й процентили, «усы» — полуторный интерквартильный размах, выбросы представлены в виде точек.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Оказалось, что средний ОУЭ гена NES статистически значимо не отличается в ММСК (0,41±0,13) и в суммарной популяции КОЕф (0,24±0,05) (рис. 1, группы ММСК и тотальная популяция КОЕф). В индивидуальных клонах КОЕф ОУЭ был статистически незначимо выше, чем в суммарной популяции (0,31±0,04) (рис. 1, группа индивидуальные клоны КОЕф).

 

Рис. 1. Относительный уровень экспрессии гена NES в мультипотентных мезенхимных стромальных клетках (ММСК) и колониеобразующих единицах фибробластов (КОЕф). Статистическая значимость различий определена с помощью U-теста Манна–Уитни.

Fig. 1. Relative expression level of NES gene in multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) and fibroblast colony forming units (CFU-F). Statistical significance of the differences was determined with Mann–Whitney U-test.

 

Очевидно, что статистически значимых отличий по уровню экспрессии нестина между двумя проанализированными типами стромальных предшественников нет.

Индивидуальные клоны КОЕф проанализированы по способности к дифференцировке в жировом и костном направлениях. В итоге все 296 проанализированных клонов были сгруппированы в 4 субпопуляции: 50% всех клонов способны к дифференцировке и в остеогенном, и в адипогенном направлении (О+А+); 43% клонов способны к остеогенной, но не к адипогенной дифференцировке (О+А–); всего 3% клонов способны к адипогенной, но не к остеогенной дифференцировке (О–А+); 4% составили клоны, не способные к данным дифференцировкам (О–А–). При анализе экспрессии нестина в клетках индивидуальных клонов КОЕф, различающихся по дифференцировочному потенциалу, наивысший ОУЭ этого гена был выявлен в группе монопотентных остеогенных предшественников (О+А–), тогда как в бипотентных предшественниках (О+А+) его экспрессия была статистически значимо ниже (рис. 2).

 

Рис. 2. Относительный уровень экспрессии гена NES в индивидуальных клонах колониеобразующих единиц фибробластов, различающихся по дифференцировочному потенциалу. Анализируемые группы: О+А+ — бипотентные предшественники, способные к остеогенной и к адипогенной дифференцировкам (n=149); О+А– — монопотентные предшественники, способные только к остеогенной дифференцировке (n=126); О–А+ — монопотентные предшественники, способные только к адипогенной дифференцировке (n=8); О–А– — стромальные клетки, не способные к указанным дифференцировкам (n=13). Статистическая значимость различий определена с помощью U-теста Манна–Уитни.

Fig. 2. Relative expression level of NES gene in individual clones of fibroblast colony forming units, which differed in their differentiation potential. The groups analyzed were О+А+ — bipotent precursors, able to osteogenic and adipogenic differentiation (n=149); О+А– — monopotent precursors able to osteogenic differentiation only (n=126); О–А+ — monopotent precursors able to adipogenic differentiation only (n=8); О–А– — stromal cells unable to differentiate toward osteogenic or adipogenic lineages (n=13). Statistical significance of the differences was determined with Mann–Whitney U-test.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ экспрессии нестина в ММСК и КОЕф не выявил различий между этими стромальными предшественниками. Однако ранее нами были показаны статистически значимые отличия в экспрессии генов, отвечающих за пролиферацию и дифференцировку в данных типах клеток-предшественниц, которые подтверждали, что это действительно два отдельных типа стромальных предшественников [13]. В мировой литературе очень часто искажают метод определения КОЕф, придуманный А.Я. Фриденштейном [16], и подменяют этим понятием анализ клоногенных клеток в культуре ММСК [17–19]. В нашей работе анализировали именно исходные, полученные непосредственно из КМ колонии КОЕф. Продемонстрировано разнообразие вариантов реализации дифференцировочного потенциала индивидуальных колоний КОЕф и убедительно показано, что самый высокий ОУЭ нестина характерен для монопотентных остеобластных предшественников, но не для бипотентных стромальных предшественников, обладающих более широким дифференцировочным потенциалом и таким образом находящихся ближе к МСК в иерархии мезенхимных предшественников. В мировой литературе имеются единичные публикации, показывающие, что высокий уровень нестина характерен как раз для МСК, локализованных в непосредственной близости к кости и направленных на остеогенную дифференцировку [20]. В настоящей работе авторы исходили из визуально выявляемой локализации нестин-положительных клеток в КМ. Однако есть и другие работы, в которых говорится о том, что экспрессия нестина характерна для ранних мультипотентных предшественников и исчезает в процессе культивирования и в более дифференцированных клетках [8]. Другими исследователями в КМ выделены две субпопуляции клеток, экспрессирующих нестин: яркие и тусклые, и получены противоречивые данные о том, какие из этих клеток являются истинными МСК [21, 22]. Необходимо отметить, что все вышеперечисленные исследования выполнены на трансгенных мышах, в геном которых под контроль промотора нестина был введён ген зелёного флуоресцентного белка. В нашей работе при анализе экспрессии гена с помощью ПЦР в режиме реального времени доказано, что стромальные монопотентные остеогенные предшественники из КМ человека обладают самым высоким уровнем экспрессии нестина среди всех проанализированных типов стромальных клеток-предшественниц.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспрессия гена NES в мезенхимных стромальных предшественниках из костного мозга не является специфичной для мезенхимных стволовых клеток и не может быть использована в качестве уникального маркёра данного типа клеток. Высокий уровень экспрессии этого гена скорее характерен для монопотентных остеогенных клеток-предшественниц.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда (проект № 22-15-00018), https://rscf.ru/project/22-15-00018/

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов: А.И. Дорофеева и И.Н. Шипунова разработали план исследования, выполнили все процедуры, связанные с получением и культивированием ММСК, КОЕф и индивидуальных клонов КОЕф из КМ здоровых доноров, а также выделили РНК и построили кДНК для всех исследованных образцов. А.И. Дорофеева и И.Н. Шипунова проанализировали экспрессию генов в ММСК и КОЕф, Т.Ф. Савватеева и И.Н. Шипунова — в индивидуальных клонах КОЕф. Все авторы принимали участие в обработке и анализе полученных данных. Все авторы внесли значимый вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией.

Благодарности. Авторы выражают благодарность генеральному директору ФГБУ «НМИЦ гематологии» Е.Н. Паровичниковой, заведующей отделением химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга и гемопоэтических стволовых клеток Л.А. Кузьминой, а также всему коллективу этого отделения за возможность получать аликвоты КМ здоровых доноров.

ADDITIONAL INFORMATION

Source of funding. The research was funded by a grant from the Russian Science Foundation (Project NO. 22-15-00018), https://rscf.ru/project/22-15-00018/

Competing Interests. The authors declare no obvious and potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Authors' contribution: A.I. Dorofeeva and I.N. Shipоunova developed the study design, performed all procedures related to the obtaining and culturing of MMSCs, CFU and individual CFU clones from BM from healthy donors, and isolated RNA and constructed cDNA for all samples studied. A.I. Dorofeeva and I.N. Shipоunova analyzed gene expression in MMSCs and CFU, T.F. Savvateeva and I.N. Shipоunova — in individual CFU clones. All authors were involved in processing and analysis of the obtained data. All authors made meaningful contributions to the study and article preparation and read and approved the final version of the article before publication.

Acknowledgements. The authors are grateful to E.N. Parovichnikova, Director General of the Hematology Research Center, to L.A. Kuzmina, Head of the Department of Haemoblastosis Chemotherapy and Bone Marrow Transplantation, as well as the entire team of this department for the opportunity to receive BM aliquots from healthy donors.

作者简介

Alena Dorofeeva

National Medical Research Center for Hematology

Email: resnichka22-22@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1154-5669
SPIN 代码: 1034-1482
俄罗斯联邦, Moscow

Tat'jana Savvateeva

Moscow School in the South-West N 1543

Email: savvateeva.tatianka@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow

Irina Shipounova

National Medical Research Center for Hematology

编辑信件的主要联系方式.
Email: iranifontova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1189-0283
SPIN 代码: 6901-6467

Dr. Sci. (Biol.)

俄罗斯联邦, Moscow

参考

补充文件