Cellular Matrix Made of Resorbed Polyhydroxialkanoats

全文:

Введение

Успешное внедрение в практику экспериментальной биологии и медицины методов длительного культивирования клеток, в том числе клеток-предшественников специализированных тканей, создали предпосылки для разработки новых технологий и подходов для реконструктивной хирургии. Используемый в тканевой инженерии междисциплинарный подход направлен в первую очередь на создание новых композиционных материалов для восстановления утраченных функций отдельных тканей или органов в целом. Основные принципы данного подхода заключаются в разработке и применении при имплантации в поврежденный орган или ткань носителей из биодеградируемых материалов, которые используются в сочетании с донорскими клетками и/или с биоактивными веществами. Трансплантация клеток в зону повреждения является наиболее ответственным этапом. Для успешной индукции гистогенеза в месте имплантации необходимо создать высокую начальную концентрацию клеток (до 10⁷-10⁸ клеток), при этом простое введение суспензии клеток может оказаться малоэффективным. Эффект трансплантации и последующего репаративного гистогенеза зависят от того, какая часть клеток попадет в зону дефекта, адгезируются ли культивированные клетки к тканям и сохранят ли при этом активное функциональное состояние [1]. Одной из сложных проблем является выбор адекватного носителя для клеток, так как для реализации своих функциональных потенций культивируемые клетки должны определенное время находиться в фиксированном к носителю состоянии. Это может быть связано с гистогенетическим свойством данных клеток проявлять свои свойства, будучи организованными в сложные трехмерные структуры. Быстрая деградация носителя-подложки способствует вымыванию клеток вместе с транссудатом из раны. Поэтому биорезорбируемые имплантаты должны иметь пролонгированный срок биодеградации [2].

Среди биоматериалов, применяемых в медицине и активно изучаемых для конструирования матриксов функционирующих клеток - альгинаты, коллаген, алифатические полиэфиры, полиамиды, сегментированные полиэфируретаны, силикон, полиэтилентерефталат, полимеры гликолевой и молочной кислот [3, 4] и с недавних пор - новый класс природных полимеров, синтезируемых микроорганизмами.

Это термопластичные линейные полиэфиры гидроксипроизводных алкановых кислот (полигидроксиалканоаты, ПГА; в англоязычной литературе PНA), которые представляют большой интерес для медицины в связи с их высокой биосовместимостью и механической прочностью. В отличие от полилактидов и полигликолидов, ПГА не подвержены гидролитической деградации в водных средах, поэтому они характеризуются медленной (месяцы и годы) кинетикой биорезорбции, при этом их деструкция в биологических средах не сопровождается изменением активной реакции среды [5, 6]. Сферы применения этих полимеров в медицине потенциально широки и могут включать изготовление медицинского инструментария и вспомогательных средств (нетканые и одноразовые изделия, шовные и перевязочные материалы), фармакологию (контролируемые системы доставки лекарственных средств), восстановительную хирургию и трансплантологию [7]. Особо перспективным считается использование ПГА в сердечно-сосудистой хирургии [8, 9], для создания матриц для биоискусственных органов [10-12], для реконструкции «мягких», костной и хрящевой тканей [13, 14].

В настоящее время ПГА активно исследуются за рубежом. Среди малотоннажных производителей ПГА - Монсанто К^o, Metabolix Inc., Tepha, Proctor & Gambel, Berlin Packaging Corp., Bioscience Ltd., BioVentures Alberta Inc., Merk, выпускающие эти полимеры под марками Biopol®, Biopol^TM,

TephaFLEX^TM, DegraPol/btc®, Nodax^TM. Такие производства в настоящее время осваивают или планируют осваивать практически все развитые страны. Следует отметить, что медико-биологические исследования ПГА до последних лет выполнялись исключительно за рубежом с применением фирменных образцов.

В России целенаправленные исследования отечественных ПГА проводятся Институтом биофизики СО РАН. Комплексные исследования включают биотехнологические аспекты синтеза полимеров различного химического состава, изучение структуры и физико-химических свойств, отработку способов получения специализированных полимерных изделий и медико-биологические исследования. Результаты этих исследований защищены серией охранных документов [15-20], включая зарегистрированную торговую марку Биопластотан™ [21], широко опубликованы в центральных российских и зарубежных журналах, а также в серии монографических изданий [22-25].

В данной работе представлен обзор результатов исследования ПГА с целью разработки матриксов различного типа для культивирования клеток.

Материал и методы

Исследованы образцы полигидроксиалканоатов, полученные в Институте биофизики СО РАН. Полимеры синтезированы бактериями Ralstonia eutropha B5786 по технологии, обеспечивающей синтез ПГА различной химической структуры [15, 16]. Исследованы два типа полимеров: полимер β-гидроксимасляной кислоты (полигидроксибутират - ПГБ), молекулярная масса 340 кДa, кристалличность 72%, температура плавления 170°С) и сополимеры гидроксибутирата и гидроксивалерата с включением гидроксивалерата (от 5 до 30 мол%), молекулярная масса 120-240 кДa, кристалличность 56-64%, температура плавления 152- 160°С. Экстракцию полимера из бактериальной биомассы проводили хлороформом (или дихлорметаном), осаждение - гексаном. Использовали оптимизированную процедуру экстракции, позволяющую получать образцы высокой степени чистоты, свободные от органических примесей белковой, углеводной и липидной природы, включая жирные кислоты (ЖК) [25]. Химическую структуру образцов и наличие микропримесей в виде длинноцепочечных и β-гидроксикислот определяли после предварительного метанолиза проб по метиловым эфирам ЖК на хроматомасс-спектрометре GCD plus (Нewlett Packard, США).

Двумерные матриксы в виде пленок получали методом полива разогретого до 35°С раствора ПГА на обезжиренную поверхность предварительно нагретых до такой же температуры чашек Петри. Высушивали пленки в беспылевом боксе при комнатной температуре в течение нескольких суток. Пористые пленки (мембраны) получали с использованием техники выщелачивания. Для этого в раствор полимера добавляли хлорид натрия; высушенные пленки для вымывания соли помещали на 48 ч. в воду. Толщину пленок и мембран измеряли микрометром; характеристики поверхности рассчитывали на базе измерения контактного краевого угла смачивания водой (θ, град): вычисляли свободную поверхностную энергию (γ_S), свободную энергию межфазовой поверхности (γ_SL) и величину сил сцепления (W_SL) (эрг/см²)

Микроструктуру матриксов в виде пленок, а также других типов (мембран, волокон, микрочастиц и др.) анализировали с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) (микроскоп JEM-100C с растровой приставкой EM-ASID-4, Япония).

Ультратонкие волокна получали методом электростатического формования. Принцип метода заключается в образовании филаментов в сильном электрическом поле, возникающем между двумя электродами противоположной зарядности, при этом один электрод был помещен в раствор полимера, второй размещен на приемном металлическом коллекторе (матрице). Источник высокого напряжения обеспечивал постоянное напряжение до 30 кВ. В ходе отработки условий формования волокон варьировали концентрацию полимера в растворе, напряжение, расстояние между иглой и мишенью, диаметр иглы.

Микросферы получали методом испарения растворителя из эмульсии (растворы полимера в дихлорметане с добавлением поливинилового спирта и/или желатина). Диспергирование эмульсии осуществляли мешалкой, оборудованной трехлопастным пропеллером. После испарения растворителя микросферы собирали центрифугированием и высушивали под вакуумом. Микроструктуру микросфер анализировали СЭМ, распределение частиц по размерам - с использованием оптической автоматизированной системы счета частиц (Casy®, Германия).

Объемные матриксы конструировали из композитов ПГА и гидроксиапатита, а также коллагена. Первый тип матриксов получали из полигидроксибутирата и биологического гидроксиапатита (ГАП) (ЗАО «Полистом», Москва). Использованы образцы ПГБ со значением молекулярной массы (Мв) 220 кДа и степени кристалличности (Сх) 70±3%, имеющие температуру плавления и деградации, соответственно, 163±2 и 210±10°С. Для создания гибридного композита ПГБ/ГАП применяли механо-физический метод. Выделенный из бактериальной биомассы хлопьевидно-волокнистый полимер измельчали; полученный гранулят полимера смешивали с ГАП; далее из смеси прямым холодным прессованием под давлением 127,2 кгс/см² формовали объемные цилиндрические компакты с различным содержанием ГАП в полимере, от 10 до 50% (по массе). Для получение пористых объемных матриксов к смеси ПГБ/ГАП перед формованием добавляли хлорид натрия, который далее вымывали из полученных изделий кипячением в воде.

Объемные пористые матриксы в виде губок получали путем модификации коллагеновой гемостатической губки (ОАО «Лужский завод Белкозин»). Губки пропитывали раствором полимера определенной плотности и далее высушивали. Для удаления из матрикса волокон коллагена, не пропитанных полимером, образцы инкубировали в 0,1% растворе коллагеназы (ICN), приготовленном на среде RPMI-1640 (ICN), при 37°С в течение 24 ч., далее высушивали.

Оценку биосовместимости матриксов проводили с использованием стандарта ИСО 10993 [26]. Цитотоксичностъ матриксов из ПГА исследовали in vitro на животных клетках разного происхождения - мезенхимального (фибробласты и клетки эндотелия) и энтодермального (гепатоциты). Были взяты культивируемые фибробласты мыши линии NIH 3Т3, относящиеся к минимально трансформированным клеточным линиям, первичные культуры паренхимных (гепатоциты) и непаренхимных (главным образом, эндотелиальных) клеток печени мыши, а также первичная культура остеобластических клеток, выделенных из мезенхимальных клеток костного мозга (МСК) крыс линии Вистар. Фибробласты NIH 3Т3 культивировали в среде DМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, НПО «Вектор», Новосибирск), 1,0 мМ L-глютамина, 10 мМ НEPES буфера и 100 мкг/мл канамицина сульфата (BDSL, UK). Гепатоциты культивировали в смеси сред DMEM+NCTC-135 (1:1) (BDSL, UK), содержащей 5% инактивированной при 56°C ЭТС, 0,1% глюкозы; 0, 2% сывороточного альбумина для клеточных культур; 0,5 мкг/мл инсулина; 50 нг/мл дексаметазона; 0,2 мкг/мл глюкагона (Sigma, США); 0,02 мМ β-меркаптоэтанола; 10 мМ НEPES буфера и 100 мкг/мл канамицина сульфата. Эндотелиальные клетки культивировали в среде Нam’s 12 (BDSL, Великобритания) c добавлением 10% ЭТС, проводя 2-3 пассажа. Клетки снимали с помощью 0,2% раствора коллагеназы, разбавленного 0,02% раствором версена. Остеобласты культивировали в гумидной среде на полной среде DMEM, содержащей 20% ЭТС, 100 Ед/мл пенициллина, 100 Ед/мл стрептомицина, 10 ммоль β-глицерофосфата, 50 г/мл L-аскорбиновой кислоты, 10 нмоль дексаметазона, с ежедневной сменой среды.

Морфологию клеток, культивируемых на полимерных матриксах, анализировали общепринятыми методами световой микроскопии; жизнеспособность - окрашиванием трипановым синим. Пролиферативную активность клеток в сравнении с контролем (стекло или полистерин) изучали в реакции с ММТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразол бромидом], (тест-МТТ, являющийся индикатором NAD(P)Н и сохранности функций митохондрий (реактивы фирмы «Sigma») и по включению меченного радионуклеидами предшественника синтеза ДНК (³Н-тимидина). Для этого клетки высевали в пенициллиновые флаконы, содержащие пленочные матриксы из ПГА в стандартной среде с добавлением метки (37 кБк/мл; 92,5 ГБк/мМ). Культивирование проводили в течение 16 ч в гумидной атмосфере с 5% CО₂ с отбором клеток для счета радиоактивности через 4 ч. Собранные клетки переносили на фильтры GF/c (Whatman), промывали по стандартной методике, высушивали и просчитывали на счетчике «Бета-1» в толуольном сцинтилляторе включившуюся в ТХУ-нерастворимый преципитат радиоактивность. Остеогенный потенциал объемных композитных матриксов полимер/ГАП и полимер/коллаген, засеянных остеобластическими клетками, полученными из МСК, оценивали после 10 суток культивирования, используя ММТ-тест; активность щелочной фосфатазы (ЩФ) - маркер дифференцировки остеобластов - определяли в реакции с паро-нитрофенолфосфатом.

Результаты и обсуждение

Общепринято, что материалы биомедицинского назначения, предназначенные для контакта со средой живого организма, должны обладать комплексом необходимых биологических свойств и физико-механических свойств. Таковыми являются - биологическая совместимость на уровне

культивируемых клеток, а также тканей макроорганизма; отсутствие токсичности, включая образуемые продукты деградации; материал должен обладать поддерживающей для клеток функцией, способствовать пролиферации и дифференцировке клеток, обеспечивать свободный доступ субстратов и отток продуктов метаболизма. Помимо необходимой механической прочности, материал должен подлежать стерилизации общепринятыми методами, обладать устойчивостью к воздействию агрессивных биологических средств и перерабатываться в изделия общепринятыми методами [26-29].

Комплексные доклинические исследования ПГА, включающие тест-системы in vitro, а также острые и хронические эксперименты на лабораторных животных, показали, что образцы ПГА, синтезированные и очищенные по технологии Института биофизики СО РАН, отвечают всем необходимым требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям для медицины. Тестирование полимеров и образцов изделий из них в виде пленочных матриксов и шовных волокон включало общепринятые санитарно-химические, токсикологические и медико-биологические тесты [26] и было проведено совместно с центром по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава (рук. Центра - проф. В.И. Севастьянов). Результаты исследований показали, что два типа ПГА, синтезированные и очищенные в Институте биофизики СО РАН, полимер гидроксимасляной кислоты (ПГБ) и сополимеры гидроксибутирата и гидроксивалерата (ПГБВ), обладают высокой биосовместимостью на уровне клеток, тканей и макроорганизма и пригодны для контакта с кровью [30-39].

Весьма важным является вопрос о механизме и кинетике деградации резорбируемых материалов в биологических средах. Биодеградация ПГА исследована в биологических средах in vitro (стабилизированная кровь, сыворотка крови) и in vivo при непосредственном контакте имплантатов (пленок, шовных нитей, микрочастиц) с тканями животных и с использованием диффузионных камер, которые препятствуют формированию фиброзной капсулы и позволяют исследовать биосовместимость и биостабильность материала с точки зрения истинной клеточной реакции. Установлено, что биодеградация ПГА протекает в биологических средах с низкими скоростями (месяцы и годы) и реализуется по гуморальному и клеточному пути с активным участием макрофагов и гигантских клеток инородных тел, характеризующихся высокой активностью кислой фосфатазы. Выявлено, что скорость биодеградации ПГА зависит от химической структуры полимера, формы полимерного изделия и места имплантации [40-41].

Для выбора адекватных способов стерилизации исследованы термостабильность и радиационная устойчивость ПГА [42]. Показано, что пленки, мембраны и шовные нити из ПГА подлежат стерилизации общепринятыми методами без изменения структуры и функциональных свойств, на этой основе показана возможность применения для стерилизации ПГА различных общепринятых методов - сухо-жарочной обработки, автоклавирования, дезинфицирующих растворов и g-облучения [39, 41, 43].

Важным свойством ПГА является возможность переработки в специальные изделия общепринятыми методами из различных фазовых состояний без применения технологических добавок и пластификаторов [5]. На основе изученных закономерностей растворимости и плавления ПГА и физико-химических характеристик полимерных растворов, гелей и расплавов получено семейство 2-х и 3-х матриксов различных типов для культивирования клеток: гибкие пленки и пористые мембраны, моножильные волокна диаметром 0,15-0,40 мм, ультратонкие волокна диаметром 1-5 мкм, микрочастицы, губки, плотные и пористые объемные матриксы, в том числе в композиции с гидроксиапатитом и коллагеном [35, 43-47].

Из растворов ПГА различной плотности методом полива получены гибкие прозрачные пленки, которые имели следующие характеристики: толщина от 0,05 до 0,1±0,01 мм, прочность 4,0±0,28 кг/мм², модуль упругости 130±28 кг/мм², удлинение при разрыве около 4% (рис.1 А). Вычисленные на базе измеренных контактных краевых углов смачивания (θ) характеристики поверхности мембран из ПГБ и ПГБ/ПГВ имели близкие значения поверхностного натяжения (γ) 34,66- 36,18, свободной энергии межфазовой поверхности 6,35-7,00, величины сил сцепления (W_SL) 100,81-102,63 эрг/см². По изученным характеристикам гидрофобная поверхность пленочных матриксов, полученных из ПГБ и ПГБ/ПГВ, близка к таковым у синтетических полиэфиров (полиэтилентерефталата, полиметилметакрилата, поливинилхлорида и полиэтилена).

Рис. 1. Структура двумерных матриксов из полигидроксибутирата (электронная микроскопия): A - гибкая пленка, маркер 10 мкм; B - мембрана, полученная с применением техники выщелачивания, маркер 10 мкм; С - мембрана, полученная осаждением трехкомпонентной системы «ПГБ-хлороформ-тетрагидрофуран», маркер 20 мкм

Общеизвестно, что свойства поверхности матриксов играют большую роль для прикрепления и пролиферации клеток. Для повышения адгезионных свойств поверхности по отношению к клеткам, улучшения газодинамических свойств изделий и повышения их проницаемости для субстратов и продуктов обмена клеток применяют различные подходы, включая обработку изделий физическими факторами или химическими реагентами. Для повышения биосовместимости матриксов из ПГА известны положительные примеры иммобилизации на поверхности пленочных матриксов коллагена [48], прививание хитозана, хитозан/полисахаридов или гиалуроновой кислоты [49].

Для повышения гидрофильности и адгезионных свойств матриксов из ПГА в центре по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава добавлением к растворам сополимера ПГБ/ПГВ в качестве пластифицирующего наполнителя полиэтиленгликоля получен вариант полимерного матрикса - ЭластоПОБ [50]. Исследование ЭластоПОБ показало, что его основные характеристики (ультраструктура поверхности, краевой угол смачивания и др.) близки к таковым у матриксов из нативного полигидроксибутирата, однако при анализе поверхности ЭластоПОБ на атомно-силовом микроскопе оказалось, что данные образцы отличаются по значениям шероховатости поверхности. Шероховатость поверхности ЭластоПОБ составила 53,8 нм, что существенно меньше показателя у исходного сополимера (82,4 нм) [51-52]. Это является позитивным моментом, так как шероховатость поверхности влияет на адгезию и распластывание клеток на матриксах, определяет их двигательную активность и другие функциональные характеристики. Показана эффективность применения ЭластоПОБ для культивирования различных типов клеток и их последующего использования для регенерации поврежденных тканей [53-54].

Один из подходов, применяемых для модификации поверхности матриксов, заключается в обработке газовой плазмой. Так, при обработке пленок из ПГА аммониевой плазмой в течение 10 мин происходило включение в структуру пленки до 8% азота, что сократило контактные краевые углы на 20-30^o, сделав поверхность более гидрофильной [55]. Сравнительно недавно стали появляться работы, в которых для улучшения свойств ПГА применяют лазерную обработку. Обработка материалов лазером имеет преимущества в сравнении с другими методами, так как позволяет прицельно модифицировать поверхности без разрушения материала и образования токсичных продуктов. Полагают, что в областях, обработанных лазером, увеличивается прочность адгезионного шва между фазами, возрастает гидрофильность и, следовательно, повышаются адгезионные свойства поверхности. На кафедре высокоэнергетических процессов политехнического Института Сибирского федерального университета под руководством профессора В.В. Слабко проведена лазерная обработка пленочных матриксов их ПГА, полученных в нашей лаборатории [56]. В связи с тем, что пленки и мембраны, изготовленные из ПГА, прозрачны в видимой и ближней ИК спектральных областях, для их обработки пригодны лазеры, генерирующие излучение с длиной волны, лежащей в дальней ИК области. Был использован СО₂-лазер, мощность которого варьировала в диапазоне от 3,0 до 30,0 Вт. Получена серия пленок с измененной поверхностью, от выраженных шероховатостей до сквозных перфораций (рис. 2A-C). Исследована микроструктура и свойства поверхности в зависимости от характера облучения и найдены условия, позволяющие снизить контактные краевые углы поверхности до 50% и существенно повысить гидрофильность матрикса без разрушения структуры материала. Прикрепляемость фибробластов и остеобластов на таких матриксах была на 18% выше по сравнению с исходными показателями.

Рис. 2. Топография поверхности пленочных матриксов из полигидроксибутирата, обработанных лазером с различной мощностью (Р) излучения (оптическая микроскопия): A - Р=6,15 Вт; B - Р= 8 Вт; С - Р=9, маркер 50 мкм

К числу основных требований, предъявляемых к матриксам для культивирования клеток, относится комбинация механической прочности с высокой объемной пористостью конструкции. Требования к размерам пор специфичны в зависимости от типа культивируемых клеток. От размера пор в матриксе зависят диффузионные свойства конструкции, определяющие отток продуктов обмена клеток и снабжение их питательными компонентами. Один из способов получения пористых полимерных матриксов получение растворов двухкомпонентных смесей, содержащих растворимый и нерастворимый в воде компоненты, и последующее выщелачивание из готового матрикса в растворе одного из компонентов. При использовании техники выщелачивания, как правило, применяют кристаллы хлорида натрия или сахарозы, которые обладают высокой растворимостью. Варьируя концентрацию последних, можно задавать общую пористость матриксов и размеры пор. На рис.1B показан в качестве примера образец пористого матрикса из ПГА, полученного таким способом. Возможно также применение трехкомпонентных смесей, состоящих из растворов полимеров и осадителей. На базе изучения растворимости полигидроксибутирата в ряде растворителей (хлороформе, дихлорэтане, тетрахлорэтане и диоксане), исследованных свойств полимерных растворов, включая поведение растворов при их взаимодействии с другими жидкостями, не являющимися растворителями для ПГА (тетрагидрофураном (ТГФ), диметилформамидом (ДМФ), этанол, вода) [57], найдены оптимальные концентрации каждого осадителя и показана пригодность таких трехкомпонентных систем для получения высокопористых полимерных матриксов с размером пор меньше 5-10 мкм (рис.1C).

Исследования полученных матриксов из ПГА двух типов (ПГБ и сополимеров ПГБ/ПГВ с различным включением гидроксивалерата) в виде пленок и мембран показало, что они обладают высокой биосовместимостью по отношению к культивируемым клеткам. Первичная оценка цитотоксичности матриксов проведена в культурах клеток [30]. Фибробласты мыши линии NIH 3T3 хорошо адгезировали на поверхности полимерных мембран из ПГБ и ПГБ/ПГВ (с включением гидроксивалерата от 4-5 до 30 мол%). Количество клеток, адгезированных на поверхности мембран после стерилизации, также было сопоставимо с контролем (стекло, полистерин). Морфология клеток, культивируемых при прямом контакте с поверхностью полученных матриксов, не отличалась от клеток в контроле, выращиваемых на стекле или полистерине. Оценка жизнеспособности клеток при помощи метода прижизненного окрашивания трипановым синим показала, что 99,8±0,2% клеток при прямом контакте с ПГБ и ПГБ/ПГВ не включали краситель, то есть сохраняли высокую жизнеспособность. В ходе изучения синтеза ДНК клетками, культивируемыми на полимерных матриксах, не обнаружено снижения включения ³Н-тимидина ядрами всех типов клеток (фибробластов, гепатоцитов и клеток эндотелоия) по сравнению с контролем, следовательно, прямой контакт клеток с поверхностью матриксов из ПГА обоих типов не приводил к ингибированию синтеза ДНК. Культивирование фибробластов и гепатоцитов в течение 3-х суток на поверхности данных матриксов не влияло на время генерации клеток и синтез белка. Эти результаты свидетельствуют о принципиальной пригодности ПГА в качестве матриксов для культивирования клеток.

К перспективным новым методам получения нетканых материалов (ультратонких волокон, мембран и микрочастиц), как модели клеточных матриксов, относят методы нанотехнологии, включая технику микроинкапсулирования и электростатического формования (ЭСФ). Принцип метода ЭСФ заключается в образовании филаментов в сильном электрическом поле, возникающем между двумя электродами противоположной зарядности, при этом один электрод помещается в раствор или расплав полимера, второй размещается на приемном металлическом коллекторе (матрице). В зависимости от разности потенциалов, молекулярной массы полимеров и плотности используемого раствора, а также расстояния между подающим и принимающим раствор устройствами образуются волокна различного диаметра и различной структуры. Примечательно, что метод ЭСФ позволяет получать ультратонкие волокна и пористые структуры на их основе из растворов и расплавов полимеров различного строения. Этот метод получил сильное развитие в настоящее время в связи с потребностями новых биомедицинских технологий клеточной и тканевой инженерии. К настоящему моменту описаны различные варианты метода для формования ультратонких волокон и мембран из полимеров различного типа. Первый пример использования метода ЭСФ для получения ультратонких волокон из ПГА реализован нами на сополимере ПГБ/ПГВ [46]. Исследовано влияние плотности полимерных растворов и параметров формования на диаметр и качество получаемых волокон, в результате выявлены оптимальные условия, позволяющие получать волокна хорошего качества диметром от 1 до 5 мкм (рис. 3A). Полученные волокна размещали на дне 26-луночных планшетов, засевали фибробластами мыши линии NIH 3Т3 и культивировали в СО₂-инкубаторе в стандартной среде. Результаты показали, что число адгезированных клеток и пролиферативная активность, измеренная в тесте ММТ, были достоверно выше, чем в контроле.

Рис. 3. Структура матриксов, полученных из полигидроксибутирата (электронная микроскопия): A - ультратонкие волокна, маркер 10 мкм; B - микрочастицы, маркер 10 мкм; С - композитная губка «коллаген/полигидроксибутират», маркер 100 мкм

Активно разрабатываемые в последние годы методы микроинкапсулирования позволяют получать микрочастицы с микро- и наноразмерным диаметром, которые в силу высочайшей развитости поверхности и возможности имплантирования подкожно, внутримышечно и инфузионно имеют огромные перспективы не только для разработки систем контролируемой доставки лекарственных средств, но и в качестве матриксов для выращивания клеток. Исследование применимости ПГА для этих целей показало возможность получения микрочастиц хорошего качества и различного диаметра [47]. При этом выявлено влияние техники изготовления (типа эмульсии и способа диспергирования, температуры среды) на выход микросфер, их структуру и размер. С применением технологии испарения растворителя из двух- и трехкомпонентной эмульсий на основе ПГА отработана процедура стабильного получения микросфер (рис. 3B). Показана высокая биосовместимость микрочастиц в культурах клеток, а также при инъекционном введении in vivo [58].

На рис. 3C показан внешний вид объемных пористых матриксов, полученных армированием коллагеновой губки покрытием из полигидроксибутирата. В ходе пропитки губки хлороформом коллаген не растворялся и не терял свою исходную форму. Содержание полимера и коллагена в полученной матрице составило 4:1 (по массе). Влагопоглощение матрицы (использованы CФБ и среда RPMI-1640) было высоким (соответственно, 94 и 97%). Композитный матрикс оказался более стабильным в жидких средах по сравнению с исходной губкой, которая несмотря на то, что коллаген плохо растворяется в воде, через сутки экспозиции в среде RPMI-1640 при 37°С теряла форму. Через неделю потеря массы губки составила 25% от исходной. В аналогичных условиях губка, армированная полимером, сохраняла форму и массу изделия длительное (до 34 суток) время. Исследование полученных матриксов в культуре фибробластов показало отсутствие токсического действия. Имплантация матриксов подкожно и внутрибрюшинно лабораторным животным показали их стабильность в течение наблюдаемого периода (60 суток).

Развитие методов клеточной и тканевой инженерии создали предпосылки для разработки новых технологий для реконструктивной ортопедии. Основную часть биоматериалов для восстановления костных дефектов до недавнего времени получали из хрящевой и/или костной тканей человека и животных. В настоящее время для реконструкции костных дефектов наиболее распространенным материалом с четко выраженной опорной функцией являются искусственные и

натуральные кальций-фосфатные материалы. Одним из подходов, направленных на улучшение механических свойств гидроксиапатита (уменьшение жесткости, повышение эластичности), стало получение композитов гидроксиапатита с синтетическими полимерами. Новым решением проблемы является создание гибридных материалов на основе гидроксиапатита и полимеров, способных к биодеградации. В связи с тем, что скорости биорезорбции ПГА in vivo в несколько раз ниже, чем у других известных биоразрушаемых биоматериалов (полилактида, полигликолида), имеется принципиальная возможность использования этих полиэфиров для долговременной регенерации крупных костных дефектов [59-61].

Механо-физическим методом нами получены объемные плотные и пористые матриксы из полигидроксибутирата и гидроксиапатита (ПГБ/ГАП) (рис. 4A, B) и исследованы структура и физико-химические свойства [45]. Композитные матриксы засевали остеобластическими клетками. Биосовместимость и функциональные свойства матриксов подтверждены in vitro в тесте ММТ и по определению активности щелочной фосфатазы (маркер дифференцировки остеобластов), а также in vivo (тест эктопического костеобразования) [44]. Показано, что сконструированные гибридные объемные матриксы из ПГБ/ГАП обладают остеогенным потенциалом, способствуют образованию костной ткани из МСК и могут быть использованы для дальнейших исследований в качестве биоактивных конструкций для регенерации дефектов костей.

Рис. 4. Структура матриксов из «полигидроксибутират/гидроксиапатит» (электронная микроскопия): A - трехмерные плотные матриксы, маркер 50 мкм; B, С - пористые матриксы, маркер 50 мкм

Таким образом, в настоящей обзорной работе представлены результаты использования полигидроксиалканоатов - резорбируемых полиэфиров микробиологического происхождения, для конструирования клеточных матриксов. Показана возможность получения дву- и трехмерных матриксов разных типов и их пригодность для выращивания клеток in vitro. Полученные результаты позволяют заключить, что этот класс термостабильных и механически прочных полимеров перспективен для создания тканеинженерных конструкций различных типов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (проект 12,5), Программы междисциплинарных интеграционных проектов СО РАН (проект № 14), Программы Президента РФ для поддержки молодых кандидатов наук (грант №МК-4149.2006), Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) и Министерства образования и науки РФ (грант №BPМ002).

作者简介

E. Shishatskaya

编辑信件的主要联系方式.
Email: shishatskaya@inbox.ru

Laboratory of hemoautotrophic biosynthesis

参考

补充文件

附件文件

动作

1. JATS XML

下载

2. Fig. 1

下载 (312KB)

索引源数据

3. Fig. 2

下载 (253KB)

索引源数据

4. Fig. 3

下载 (240KB)

索引源数据

5. Fig. 4

下载 (214KB)

索引源数据