Cellular Matrix Made of Resorbed Polyhydroxialkanoats

封面

如何引用文章

全文:

详细

The article presents the results of a study of resorbed polyhydroxialkanoats (linear polyesters of microbiologic origin) aptitude for different cellular matrix development. ln the experiment samples of high-purity polyhydroxialkanoats produced by Ralstonia eutropha B 5786 bacteria were used. A technology to produce polyhydroxialkanoats of various chemical structures is developed in the Institute of Biophysics of the Siberian branch of the Russian Academy of Sciences. Using polyhydroxialkanoats in different phase states (solutions, emulsions, powder) a structure and properties of two- and tree-dimentional matrix such as flexible transparent slick, membrane, fine fibres, microparticles, sponge, volumetric solid and porous structures are produced and studied. The matrix can be sterilized with standard methods without changing its structure, stability loss or adhesion quality deterioration as well as its fitness for growing cells in vitro. Matrix biocompatibility was assessed in cultures of fibroblasts, hepatocytes, endothelial cells and osteoblasts in vitro. Microscopy, inter vivos/alive staining with tripan blue, detection of protein and ONA synthesis by cells being cultured, as well as MMT have not shown polyhydroxialkanoat matrix to be cytotoxic in a direct contact with any type of cells used. The data obtained allow to recommend polyhydroxialkanoats - new type of thermpstable, biocompatible and resorbed polyester - for development of different constructions for cellular therapy and tissue engineering.

全文:

Введение

Успешное внедрение в практику экспериментальной биологии и медицины методов длительного культивирования клеток, в том числе клеток-предшественников специализированных тканей, создали предпосылки для разработки новых технологий и подходов для реконструктивной хирургии. Используемый в тканевой инженерии междисциплинарный подход направлен в первую очередь на создание новых композиционных материалов для восстановления утраченных функций отдельных тканей или органов в целом. Основные принципы данного подхода заключаются в разработке и применении при имплантации в поврежденный орган или ткань носителей из биодеградируемых материалов, которые используются в сочетании с донорскими клетками и/или с биоактивными веществами. Трансплантация клеток в зону повреждения является наиболее ответственным этапом. Для успешной индукции гистогенеза в месте имплантации необходимо создать высокую начальную концентрацию клеток (до 107-108 клеток), при этом простое введение суспензии клеток может оказаться малоэффективным. Эффект трансплантации и последующего репаративного гистогенеза зависят от того, какая часть клеток попадет в зону дефекта, адгезируются ли культивированные клетки к тканям и сохранят ли при этом активное функциональное состояние [1]. Одной из сложных проблем является выбор адекватного носителя для клеток, так как для реализации своих функциональных потенций культивируемые клетки должны определенное время находиться в фиксированном к носителю состоянии. Это может быть связано с гистогенетическим свойством данных клеток проявлять свои свойства, будучи организованными в сложные трехмерные структуры. Быстрая деградация носителя-подложки способствует вымыванию клеток вместе с транссудатом из раны. Поэтому биорезорбируемые имплантаты должны иметь пролонгированный срок биодеградации [2].

Среди биоматериалов, применяемых в медицине и активно изучаемых для конструирования матриксов функционирующих клеток - альгинаты, коллаген, алифатические полиэфиры, полиамиды, сегментированные полиэфируретаны, силикон, полиэтилентерефталат, полимеры гликолевой и молочной кислот [3, 4] и с недавних пор - новый класс природных полимеров, синтезируемых микроорганизмами.

Это термопластичные линейные полиэфиры гидроксипроизводных алкановых кислот (полигидроксиалканоаты, ПГА; в англоязычной литературе PНA), которые представляют большой интерес для медицины в связи с их высокой биосовместимостью и механической прочностью. В отличие от полилактидов и полигликолидов, ПГА не подвержены гидролитической деградации в водных средах, поэтому они характеризуются медленной (месяцы и годы) кинетикой биорезорбции, при этом их деструкция в биологических средах не сопровождается изменением активной реакции среды [5, 6]. Сферы применения этих полимеров в медицине потенциально широки и могут включать изготовление медицинского инструментария и вспомогательных средств (нетканые и одноразовые изделия, шовные и перевязочные материалы), фармакологию (контролируемые системы доставки лекарственных средств), восстановительную хирургию и трансплантологию [7]. Особо перспективным считается использование ПГА в сердечно-сосудистой хирургии [8, 9], для создания матриц для биоискусственных органов [10-12], для реконструкции «мягких», костной и хрящевой тканей [13, 14].

В настоящее время ПГА активно исследуются за рубежом. Среди малотоннажных производителей ПГА - Монсанто Кo, Metabolix Inc., Tepha, Proctor & Gambel, Berlin Packaging Corp., Bioscience Ltd., BioVentures Alberta Inc., Merk, выпускающие эти полимеры под марками Biopol®, BiopolTM,

TephaFLEXTM, DegraPol/btc®, NodaxTM. Такие производства в настоящее время осваивают или планируют осваивать практически все развитые страны. Следует отметить, что медико-биологические исследования ПГА до последних лет выполнялись исключительно за рубежом с применением фирменных образцов.

В России целенаправленные исследования отечественных ПГА проводятся Институтом биофизики СО РАН. Комплексные исследования включают биотехнологические аспекты синтеза полимеров различного химического состава, изучение структуры и физико-химических свойств, отработку способов получения специализированных полимерных изделий и медико-биологические исследования. Результаты этих исследований защищены серией охранных документов [15-20], включая зарегистрированную торговую марку Биопластотан™ [21], широко опубликованы в центральных российских и зарубежных журналах, а также в серии монографических изданий [22-25].

В данной работе представлен обзор результатов исследования ПГА с целью разработки матриксов различного типа для культивирования клеток.

Материал и методы

Исследованы образцы полигидроксиалканоатов, полученные в Институте биофизики СО РАН. Полимеры синтезированы бактериями Ralstonia eutropha B5786 по технологии, обеспечивающей синтез ПГА различной химической структуры [15, 16]. Исследованы два типа полимеров: полимер β-гидроксимасляной кислоты (полигидроксибутират - ПГБ), молекулярная масса 340 кДa, кристалличность 72%, температура плавления 170°С) и сополимеры гидроксибутирата и гидроксивалерата с включением гидроксивалерата (от 5 до 30 мол%), молекулярная масса 120-240 кДa, кристалличность 56-64%, температура плавления 152- 160°С. Экстракцию полимера из бактериальной биомассы проводили хлороформом (или дихлорметаном), осаждение - гексаном. Использовали оптимизированную процедуру экстракции, позволяющую получать образцы высокой степени чистоты, свободные от органических примесей белковой, углеводной и липидной природы, включая жирные кислоты (ЖК) [25]. Химическую структуру образцов и наличие микропримесей в виде длинноцепочечных и β-гидроксикислот определяли после предварительного метанолиза проб по метиловым эфирам ЖК на хроматомасс-спектрометре GCD plus (Нewlett Packard, США).

Двумерные матриксы в виде пленок получали методом полива разогретого до 35°С раствора ПГА на обезжиренную поверхность предварительно нагретых до такой же температуры чашек Петри. Высушивали пленки в беспылевом боксе при комнатной температуре в течение нескольких суток. Пористые пленки (мембраны) получали с использованием техники выщелачивания. Для этого в раствор полимера добавляли хлорид натрия; высушенные пленки для вымывания соли помещали на 48 ч. в воду. Толщину пленок и мембран измеряли микрометром; характеристики поверхности рассчитывали на базе измерения контактного краевого угла смачивания водой (θ, град): вычисляли свободную поверхностную энергию (γS), свободную энергию межфазовой поверхности (γSL) и величину сил сцепления (WSL) (эрг/см2)

Микроструктуру матриксов в виде пленок, а также других типов (мембран, волокон, микрочастиц и др.) анализировали с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) (микроскоп JEM-100C с растровой приставкой EM-ASID-4, Япония).

Ультратонкие волокна получали методом электростатического формования. Принцип метода заключается в образовании филаментов в сильном электрическом поле, возникающем между двумя электродами противоположной зарядности, при этом один электрод был помещен в раствор полимера, второй размещен на приемном металлическом коллекторе (матрице). Источник высокого напряжения обеспечивал постоянное напряжение до 30 кВ. В ходе отработки условий формования волокон варьировали концентрацию полимера в растворе, напряжение, расстояние между иглой и мишенью, диаметр иглы.

Микросферы получали методом испарения растворителя из эмульсии (растворы полимера в дихлорметане с добавлением поливинилового спирта и/или желатина). Диспергирование эмульсии осуществляли мешалкой, оборудованной трехлопастным пропеллером. После испарения растворителя микросферы собирали центрифугированием и высушивали под вакуумом. Микроструктуру микросфер анализировали СЭМ, распределение частиц по размерам - с использованием оптической автоматизированной системы счета частиц (Casy®, Германия).

Объемные матриксы конструировали из композитов ПГА и гидроксиапатита, а также коллагена. Первый тип матриксов получали из полигидроксибутирата и биологического гидроксиапатита (ГАП) (ЗАО «Полистом», Москва). Использованы образцы ПГБ со значением молекулярной массы (Мв) 220 кДа и степени кристалличности (Сх) 70±3%, имеющие температуру плавления и деградации, соответственно, 163±2 и 210±10°С. Для создания гибридного композита ПГБ/ГАП применяли механо-физический метод. Выделенный из бактериальной биомассы хлопьевидно-волокнистый полимер измельчали; полученный гранулят полимера смешивали с ГАП; далее из смеси прямым холодным прессованием под давлением 127,2 кгс/см2 формовали объемные цилиндрические компакты с различным содержанием ГАП в полимере, от 10 до 50% (по массе). Для получение пористых объемных матриксов к смеси ПГБ/ГАП перед формованием добавляли хлорид натрия, который далее вымывали из полученных изделий кипячением в воде.

Объемные пористые матриксы в виде губок получали путем модификации коллагеновой гемостатической губки (ОАО «Лужский завод Белкозин»). Губки пропитывали раствором полимера определенной плотности и далее высушивали. Для удаления из матрикса волокон коллагена, не пропитанных полимером, образцы инкубировали в 0,1% растворе коллагеназы (ICN), приготовленном на среде RPMI-1640 (ICN), при 37°С в течение 24 ч., далее высушивали.

Оценку биосовместимости матриксов проводили с использованием стандарта ИСО 10993 [26]. Цитотоксичностъ матриксов из ПГА исследовали in vitro на животных клетках разного происхождения - мезенхимального (фибробласты и клетки эндотелия) и энтодермального (гепатоциты). Были взяты культивируемые фибробласты мыши линии NIH 3Т3, относящиеся к минимально трансформированным клеточным линиям, первичные культуры паренхимных (гепатоциты) и непаренхимных (главным образом, эндотелиальных) клеток печени мыши, а также первичная культура остеобластических клеток, выделенных из мезенхимальных клеток костного мозга (МСК) крыс линии Вистар. Фибробласты NIH 3Т3 культивировали в среде DМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, НПО «Вектор», Новосибирск), 1,0 мМ L-глютамина, 10 мМ НEPES буфера и 100 мкг/мл канамицина сульфата (BDSL, UK). Гепатоциты культивировали в смеси сред DMEM+NCTC-135 (1:1) (BDSL, UK), содержащей 5% инактивированной при 56°C ЭТС, 0,1% глюкозы; 0, 2% сывороточного альбумина для клеточных культур; 0,5 мкг/мл инсулина; 50 нг/мл дексаметазона; 0,2 мкг/мл глюкагона (Sigma, США); 0,02 мМ β-меркаптоэтанола; 10 мМ НEPES буфера и 100 мкг/мл канамицина сульфата. Эндотелиальные клетки культивировали в среде Нam’s 12 (BDSL, Великобритания) c добавлением 10% ЭТС, проводя 2-3 пассажа. Клетки снимали с помощью 0,2% раствора коллагеназы, разбавленного 0,02% раствором версена. Остеобласты культивировали в гумидной среде на полной среде DMEM, содержащей 20% ЭТС, 100 Ед/мл пенициллина, 100 Ед/мл стрептомицина, 10 ммоль β-глицерофосфата, 50 г/мл L-аскорбиновой кислоты, 10 нмоль дексаметазона, с ежедневной сменой среды.

Морфологию клеток, культивируемых на полимерных матриксах, анализировали общепринятыми методами световой микроскопии; жизнеспособность - окрашиванием трипановым синим. Пролиферативную активность клеток в сравнении с контролем (стекло или полистерин) изучали в реакции с ММТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразол бромидом], (тест-МТТ, являющийся индикатором NAD(P)Н и сохранности функций митохондрий (реактивы фирмы «Sigma») и по включению меченного радионуклеидами предшественника синтеза ДНК (3Н-тимидина). Для этого клетки высевали в пенициллиновые флаконы, содержащие пленочные матриксы из ПГА в стандартной среде с добавлением метки (37 кБк/мл; 92,5 ГБк/мМ). Культивирование проводили в течение 16 ч в гумидной атмосфере с 5% CО2 с отбором клеток для счета радиоактивности через 4 ч. Собранные клетки переносили на фильтры GF/c (Whatman), промывали по стандартной методике, высушивали и просчитывали на счетчике «Бета-1» в толуольном сцинтилляторе включившуюся в ТХУ-нерастворимый преципитат радиоактивность. Остеогенный потенциал объемных композитных матриксов полимер/ГАП и полимер/коллаген, засеянных остеобластическими клетками, полученными из МСК, оценивали после 10 суток культивирования, используя ММТ-тест; активность щелочной фосфатазы (ЩФ) - маркер дифференцировки остеобластов - определяли в реакции с паро-нитрофенолфосфатом.

Результаты и обсуждение

Общепринято, что материалы биомедицинского назначения, предназначенные для контакта со средой живого организма, должны обладать комплексом необходимых биологических свойств и физико-механических свойств. Таковыми являются - биологическая совместимость на уровне

культивируемых клеток, а также тканей макроорганизма; отсутствие токсичности, включая образуемые продукты деградации; материал должен обладать поддерживающей для клеток функцией, способствовать пролиферации и дифференцировке клеток, обеспечивать свободный доступ субстратов и отток продуктов метаболизма. Помимо необходимой механической прочности, материал должен подлежать стерилизации общепринятыми методами, обладать устойчивостью к воздействию агрессивных биологических средств и перерабатываться в изделия общепринятыми методами [26-29].

Комплексные доклинические исследования ПГА, включающие тест-системы in vitro, а также острые и хронические эксперименты на лабораторных животных, показали, что образцы ПГА, синтезированные и очищенные по технологии Института биофизики СО РАН, отвечают всем необходимым требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям для медицины. Тестирование полимеров и образцов изделий из них в виде пленочных матриксов и шовных волокон включало общепринятые санитарно-химические, токсикологические и медико-биологические тесты [26] и было проведено совместно с центром по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава (рук. Центра - проф. В.И. Севастьянов). Результаты исследований показали, что два типа ПГА, синтезированные и очищенные в Институте биофизики СО РАН, полимер гидроксимасляной кислоты (ПГБ) и сополимеры гидроксибутирата и гидроксивалерата (ПГБВ), обладают высокой биосовместимостью на уровне клеток, тканей и макроорганизма и пригодны для контакта с кровью [30-39].

Весьма важным является вопрос о механизме и кинетике деградации резорбируемых материалов в биологических средах. Биодеградация ПГА исследована в биологических средах in vitro (стабилизированная кровь, сыворотка крови) и in vivo при непосредственном контакте имплантатов (пленок, шовных нитей, микрочастиц) с тканями животных и с использованием диффузионных камер, которые препятствуют формированию фиброзной капсулы и позволяют исследовать биосовместимость и биостабильность материала с точки зрения истинной клеточной реакции. Установлено, что биодеградация ПГА протекает в биологических средах с низкими скоростями (месяцы и годы) и реализуется по гуморальному и клеточному пути с активным участием макрофагов и гигантских клеток инородных тел, характеризующихся высокой активностью кислой фосфатазы. Выявлено, что скорость биодеградации ПГА зависит от химической структуры полимера, формы полимерного изделия и места имплантации [40-41].

Для выбора адекватных способов стерилизации исследованы термостабильность и радиационная устойчивость ПГА [42]. Показано, что пленки, мембраны и шовные нити из ПГА подлежат стерилизации общепринятыми методами без изменения структуры и функциональных свойств, на этой основе показана возможность применения для стерилизации ПГА различных общепринятых методов - сухо-жарочной обработки, автоклавирования, дезинфицирующих растворов и g-облучения [39, 41, 43].

Важным свойством ПГА является возможность переработки в специальные изделия общепринятыми методами из различных фазовых состояний без применения технологических добавок и пластификаторов [5]. На основе изученных закономерностей растворимости и плавления ПГА и физико-химических характеристик полимерных растворов, гелей и расплавов получено семейство 2-х и 3-х матриксов различных типов для культивирования клеток: гибкие пленки и пористые мембраны, моножильные волокна диаметром 0,15-0,40 мм, ультратонкие волокна диаметром 1-5 мкм, микрочастицы, губки, плотные и пористые объемные матриксы, в том числе в композиции с гидроксиапатитом и коллагеном [35, 43-47].

Из растворов ПГА различной плотности методом полива получены гибкие прозрачные пленки, которые имели следующие характеристики: толщина от 0,05 до 0,1±0,01 мм, прочность 4,0±0,28 кг/мм2, модуль упругости 130±28 кг/мм2, удлинение при разрыве около 4% (рис.1 А). Вычисленные на базе измеренных контактных краевых углов смачивания (θ) характеристики поверхности мембран из ПГБ и ПГБ/ПГВ имели близкие значения поверхностного натяжения (γ) 34,66- 36,18, свободной энергии межфазовой поверхности 6,35-7,00, величины сил сцепления (WSL) 100,81-102,63 эрг/см2. По изученным характеристикам гидрофобная поверхность пленочных матриксов, полученных из ПГБ и ПГБ/ПГВ, близка к таковым у синтетических полиэфиров (полиэтилентерефталата, полиметилметакрилата, поливинилхлорида и полиэтилена).

 

Рис. 1. Структура двумерных матриксов из полигидроксибутирата (электронная микроскопия): A - гибкая пленка, маркер 10 мкм; B - мембрана, полученная с применением техники выщелачивания, маркер 10 мкм; С - мембрана, полученная осаждением трехкомпонентной системы «ПГБ-хлороформ-тетрагидрофуран», маркер 20 мкм

 

Общеизвестно, что свойства поверхности матриксов играют большую роль для прикрепления и пролиферации клеток. Для повышения адгезионных свойств поверхности по отношению к клеткам, улучшения газодинамических свойств изделий и повышения их проницаемости для субстратов и продуктов обмена клеток применяют различные подходы, включая обработку изделий физическими факторами или химическими реагентами. Для повышения биосовместимости матриксов из ПГА известны положительные примеры иммобилизации на поверхности пленочных матриксов коллагена [48], прививание хитозана, хитозан/полисахаридов или гиалуроновой кислоты [49].

Для повышения гидрофильности и адгезионных свойств матриксов из ПГА в центре по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава добавлением к растворам сополимера ПГБ/ПГВ в качестве пластифицирующего наполнителя полиэтиленгликоля получен вариант полимерного матрикса - ЭластоПОБ [50]. Исследование ЭластоПОБ показало, что его основные характеристики (ультраструктура поверхности, краевой угол смачивания и др.) близки к таковым у матриксов из нативного полигидроксибутирата, однако при анализе поверхности ЭластоПОБ на атомно-силовом микроскопе оказалось, что данные образцы отличаются по значениям шероховатости поверхности. Шероховатость поверхности ЭластоПОБ составила 53,8 нм, что существенно меньше показателя у исходного сополимера (82,4 нм) [51-52]. Это является позитивным моментом, так как шероховатость поверхности влияет на адгезию и распластывание клеток на матриксах, определяет их двигательную активность и другие функциональные характеристики. Показана эффективность применения ЭластоПОБ для культивирования различных типов клеток и их последующего использования для регенерации поврежденных тканей [53-54].

Один из подходов, применяемых для модификации поверхности матриксов, заключается в обработке газовой плазмой. Так, при обработке пленок из ПГА аммониевой плазмой в течение 10 мин происходило включение в структуру пленки до 8% азота, что сократило контактные краевые углы на 20-30o, сделав поверхность более гидрофильной [55]. Сравнительно недавно стали появляться работы, в которых для улучшения свойств ПГА применяют лазерную обработку. Обработка материалов лазером имеет преимущества в сравнении с другими методами, так как позволяет прицельно модифицировать поверхности без разрушения материала и образования токсичных продуктов. Полагают, что в областях, обработанных лазером, увеличивается прочность адгезионного шва между фазами, возрастает гидрофильность и, следовательно, повышаются адгезионные свойства поверхности. На кафедре высокоэнергетических процессов политехнического Института Сибирского федерального университета под руководством профессора В.В. Слабко проведена лазерная обработка пленочных матриксов их ПГА, полученных в нашей лаборатории [56]. В связи с тем, что пленки и мембраны, изготовленные из ПГА, прозрачны в видимой и ближней ИК спектральных областях, для их обработки пригодны лазеры, генерирующие излучение с длиной волны, лежащей в дальней ИК области. Был использован СО2-лазер, мощность которого варьировала в диапазоне от 3,0 до 30,0 Вт. Получена серия пленок с измененной поверхностью, от выраженных шероховатостей до сквозных перфораций (рис. 2A-C). Исследована микроструктура и свойства поверхности в зависимости от характера облучения и найдены условия, позволяющие снизить контактные краевые углы поверхности до 50% и существенно повысить гидрофильность матрикса без разрушения структуры материала. Прикрепляемость фибробластов и остеобластов на таких матриксах была на 18% выше по сравнению с исходными показателями.

 

Рис. 2. Топография поверхности пленочных матриксов из полигидроксибутирата, обработанных лазером с различной мощностью (Р) излучения (оптическая микроскопия): A - Р=6,15 Вт; B - Р= 8 Вт; С - Р=9, маркер 50 мкм

 

К числу основных требований, предъявляемых к матриксам для культивирования клеток, относится комбинация механической прочности с высокой объемной пористостью конструкции. Требования к размерам пор специфичны в зависимости от типа культивируемых клеток. От размера пор в матриксе зависят диффузионные свойства конструкции, определяющие отток продуктов обмена клеток и снабжение их питательными компонентами. Один из способов получения пористых полимерных матриксов получение растворов двухкомпонентных смесей, содержащих растворимый и нерастворимый в воде компоненты, и последующее выщелачивание из готового матрикса в растворе одного из компонентов. При использовании техники выщелачивания, как правило, применяют кристаллы хлорида натрия или сахарозы, которые обладают высокой растворимостью. Варьируя концентрацию последних, можно задавать общую пористость матриксов и размеры пор. На рис.1B показан в качестве примера образец пористого матрикса из ПГА, полученного таким способом. Возможно также применение трехкомпонентных смесей, состоящих из растворов полимеров и осадителей. На базе изучения растворимости полигидроксибутирата в ряде растворителей (хлороформе, дихлорэтане, тетрахлорэтане и диоксане), исследованных свойств полимерных растворов, включая поведение растворов при их взаимодействии с другими жидкостями, не являющимися растворителями для ПГА (тетрагидрофураном (ТГФ), диметилформамидом (ДМФ), этанол, вода) [57], найдены оптимальные концентрации каждого осадителя и показана пригодность таких трехкомпонентных систем для получения высокопористых полимерных матриксов с размером пор меньше 5-10 мкм (рис.1C).

Исследования полученных матриксов из ПГА двух типов (ПГБ и сополимеров ПГБ/ПГВ с различным включением гидроксивалерата) в виде пленок и мембран показало, что они обладают высокой биосовместимостью по отношению к культивируемым клеткам. Первичная оценка цитотоксичности матриксов проведена в культурах клеток [30]. Фибробласты мыши линии NIH 3T3 хорошо адгезировали на поверхности полимерных мембран из ПГБ и ПГБ/ПГВ (с включением гидроксивалерата от 4-5 до 30 мол%). Количество клеток, адгезированных на поверхности мембран после стерилизации, также было сопоставимо с контролем (стекло, полистерин). Морфология клеток, культивируемых при прямом контакте с поверхностью полученных матриксов, не отличалась от клеток в контроле, выращиваемых на стекле или полистерине. Оценка жизнеспособности клеток при помощи метода прижизненного окрашивания трипановым синим показала, что 99,8±0,2% клеток при прямом контакте с ПГБ и ПГБ/ПГВ не включали краситель, то есть сохраняли высокую жизнеспособность. В ходе изучения синтеза ДНК клетками, культивируемыми на полимерных матриксах, не обнаружено снижения включения 3Н-тимидина ядрами всех типов клеток (фибробластов, гепатоцитов и клеток эндотелоия) по сравнению с контролем, следовательно, прямой контакт клеток с поверхностью матриксов из ПГА обоих типов не приводил к ингибированию синтеза ДНК. Культивирование фибробластов и гепатоцитов в течение 3-х суток на поверхности данных матриксов не влияло на время генерации клеток и синтез белка. Эти результаты свидетельствуют о принципиальной пригодности ПГА в качестве матриксов для культивирования клеток.

К перспективным новым методам получения нетканых материалов (ультратонких волокон, мембран и микрочастиц), как модели клеточных матриксов, относят методы нанотехнологии, включая технику микроинкапсулирования и электростатического формования (ЭСФ). Принцип метода ЭСФ заключается в образовании филаментов в сильном электрическом поле, возникающем между двумя электродами противоположной зарядности, при этом один электрод помещается в раствор или расплав полимера, второй размещается на приемном металлическом коллекторе (матрице). В зависимости от разности потенциалов, молекулярной массы полимеров и плотности используемого раствора, а также расстояния между подающим и принимающим раствор устройствами образуются волокна различного диаметра и различной структуры. Примечательно, что метод ЭСФ позволяет получать ультратонкие волокна и пористые структуры на их основе из растворов и расплавов полимеров различного строения. Этот метод получил сильное развитие в настоящее время в связи с потребностями новых биомедицинских технологий клеточной и тканевой инженерии. К настоящему моменту описаны различные варианты метода для формования ультратонких волокон и мембран из полимеров различного типа. Первый пример использования метода ЭСФ для получения ультратонких волокон из ПГА реализован нами на сополимере ПГБ/ПГВ [46]. Исследовано влияние плотности полимерных растворов и параметров формования на диаметр и качество получаемых волокон, в результате выявлены оптимальные условия, позволяющие получать волокна хорошего качества диметром от 1 до 5 мкм (рис. 3A). Полученные волокна размещали на дне 26-луночных планшетов, засевали фибробластами мыши линии NIH 3Т3 и культивировали в СО2-инкубаторе в стандартной среде. Результаты показали, что число адгезированных клеток и пролиферативная активность, измеренная в тесте ММТ, были достоверно выше, чем в контроле.

 

Рис. 3. Структура матриксов, полученных из полигидроксибутирата (электронная микроскопия): A - ультратонкие волокна, маркер 10 мкм; B - микрочастицы, маркер 10 мкм; С - композитная губка «коллаген/полигидроксибутират», маркер 100 мкм

 

Активно разрабатываемые в последние годы методы микроинкапсулирования позволяют получать микрочастицы с микро- и наноразмерным диаметром, которые в силу высочайшей развитости поверхности и возможности имплантирования подкожно, внутримышечно и инфузионно имеют огромные перспективы не только для разработки систем контролируемой доставки лекарственных средств, но и в качестве матриксов для выращивания клеток. Исследование применимости ПГА для этих целей показало возможность получения микрочастиц хорошего качества и различного диаметра [47]. При этом выявлено влияние техники изготовления (типа эмульсии и способа диспергирования, температуры среды) на выход микросфер, их структуру и размер. С применением технологии испарения растворителя из двух- и трехкомпонентной эмульсий на основе ПГА отработана процедура стабильного получения микросфер (рис. 3B). Показана высокая биосовместимость микрочастиц в культурах клеток, а также при инъекционном введении in vivo [58].

На рис. 3C показан внешний вид объемных пористых матриксов, полученных армированием коллагеновой губки покрытием из полигидроксибутирата. В ходе пропитки губки хлороформом коллаген не растворялся и не терял свою исходную форму. Содержание полимера и коллагена в полученной матрице составило 4:1 (по массе). Влагопоглощение матрицы (использованы CФБ и среда RPMI-1640) было высоким (соответственно, 94 и 97%). Композитный матрикс оказался более стабильным в жидких средах по сравнению с исходной губкой, которая несмотря на то, что коллаген плохо растворяется в воде, через сутки экспозиции в среде RPMI-1640 при 37°С теряла форму. Через неделю потеря массы губки составила 25% от исходной. В аналогичных условиях губка, армированная полимером, сохраняла форму и массу изделия длительное (до 34 суток) время. Исследование полученных матриксов в культуре фибробластов показало отсутствие токсического действия. Имплантация матриксов подкожно и внутрибрюшинно лабораторным животным показали их стабильность в течение наблюдаемого периода (60 суток).

Развитие методов клеточной и тканевой инженерии создали предпосылки для разработки новых технологий для реконструктивной ортопедии. Основную часть биоматериалов для восстановления костных дефектов до недавнего времени получали из хрящевой и/или костной тканей человека и животных. В настоящее время для реконструкции костных дефектов наиболее распространенным материалом с четко выраженной опорной функцией являются искусственные и

натуральные кальций-фосфатные материалы. Одним из подходов, направленных на улучшение механических свойств гидроксиапатита (уменьшение жесткости, повышение эластичности), стало получение композитов гидроксиапатита с синтетическими полимерами. Новым решением проблемы является создание гибридных материалов на основе гидроксиапатита и полимеров, способных к биодеградации. В связи с тем, что скорости биорезорбции ПГА in vivo в несколько раз ниже, чем у других известных биоразрушаемых биоматериалов (полилактида, полигликолида), имеется принципиальная возможность использования этих полиэфиров для долговременной регенерации крупных костных дефектов [59-61].

Механо-физическим методом нами получены объемные плотные и пористые матриксы из полигидроксибутирата и гидроксиапатита (ПГБ/ГАП) (рис. 4A, B) и исследованы структура и физико-химические свойства [45]. Композитные матриксы засевали остеобластическими клетками. Биосовместимость и функциональные свойства матриксов подтверждены in vitro в тесте ММТ и по определению активности щелочной фосфатазы (маркер дифференцировки остеобластов), а также in vivo (тест эктопического костеобразования) [44]. Показано, что сконструированные гибридные объемные матриксы из ПГБ/ГАП обладают остеогенным потенциалом, способствуют образованию костной ткани из МСК и могут быть использованы для дальнейших исследований в качестве биоактивных конструкций для регенерации дефектов костей.

 

Рис. 4. Структура матриксов из «полигидроксибутират/гидроксиапатит» (электронная микроскопия): A - трехмерные плотные матриксы, маркер 50 мкм; B, С - пористые матриксы, маркер 50 мкм

 

Таким образом, в настоящей обзорной работе представлены результаты использования полигидроксиалканоатов - резорбируемых полиэфиров микробиологического происхождения, для конструирования клеточных матриксов. Показана возможность получения дву- и трехмерных матриксов разных типов и их пригодность для выращивания клеток in vitro. Полученные результаты позволяют заключить, что этот класс термостабильных и механически прочных полимеров перспективен для создания тканеинженерных конструкций различных типов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (проект 12,5), Программы междисциплинарных интеграционных проектов СО РАН (проект № 14), Программы Президента РФ для поддержки молодых кандидатов наук (грант №МК-4149.2006), Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) и Министерства образования и науки РФ (грант №BPМ002).

×

作者简介

E. Shishatskaya

Institute of Biophysics, Siberian Branch of RAS

编辑信件的主要联系方式.
Email: shishatskaya@inbox.ru

Laboratory of hemoautotrophic biosynthesis

俄罗斯联邦, Krasnojarsk

参考

  1. Shih H.N., Fang J.F., Chen J.H. et al. Reduction in experimental peridural adhesion with the use of crosslinked hyaluronate/collagen membrane. J. Biomed. Mater. Res. 2004; 71B: 421-8.
  2. Wang M., Chen L.J., Weng J. et al. Manufacture and evaluation of bioactive and biodegradable materials ans scaffolds for tissue engineering. J. Mater. Sci.: Materials in Medicine 2002; 12: 856-60.
  3. Kokubo T., Kim H., Kawashita M. Novel bioactive materials with different machanical properties. Biomaterials 2003; 24: 2161-5.
  4. Shin H., Jo S., Mikos A.G. Biomimetic materials for tissue engineering. Biomaterials 2003; 24: 4353-64.
  5. Amass W., Amass A., Tighe B. A Review of Biodegradale Polymers: Uses, Current Developments in the Synthesis and Characterization of Biodegradable Polyesters, Blends of Biodegradable Polymers and Recent Advances in Biodegradation Studies. Polym. Int. 1998; 47: 89-144.
  6. Sudesh K., Abe H., Doi Y. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Prog. Polym. Sci. 2000; 25:1503-55.
  7. Asrar J., Gruys K.J. Biodegradable Polymer (Biopol®). In: Doi Y., Steinbschel A., editors. Biopolymers. Weinheim: Wiley - VCH; 2002: 4; 53-90.
  8. Martin D.P., Williams S.F. Medical application of poly-4-hydroxybutyrate: a strong flexible absorbable biomaterial. Biochem. Engineering J. 2006;16: 97-105.
  9. Hasirci V., Vrana E., Zorlutuna P. et al. Nanobiomaterials: a review of the existing science and technology, new approaches. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2006; 17: 1241-68.
  10. Sodian R., Hoerstrup S.P., Sperling J.S. et al. Tissue engineering of heart valves: in vitro experiences. The Annal. Thorac. Surg. 2000; 70:140-4.
  11. Hoerstrup S.P., Sodian R., Dzebris S. et al. Functional trileflet heart valves grown in vitro. Circulation 2000; 102: 44-9.
  12. Stock U., Nagashima M., Khalil P.N. et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2000; 119: 732-40.
  13. Tsresin F., Gsrsel I., Hasirci V. Biodegradable polyhydroxyalkanoate implants for osteomyelitis therapy: in vitro antibiotic release. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2001; 12: 195-207.
  14. Korkusuz F., Korkusaz P., Eksioglu F., et al. In vivo response to controlled antibiotic release systems. J. Biomed. Mater. Res. 2001; 55: 217-28.
  15. Волова Т.Г., Калачева Г.С. Способ получения полимера р-оксимасляной кислоты. Патент РФ № 2051967.1996
  16. Волова Т.Г., Калачева Г.С., Константинова В.М. Способ получения гетерополимера в-оксимасляной и в-оксивалериановой кислот. Патент РФ № 2051968. 1996.
  17. Волова Т.Г., Янголов О.В., Коновалов Н.М., Коханов Ю.Г. Способ культивирования водородокисляющихбактерий. Патент РФ № 2051962.1996.
  18. Отасишина Г.Т, Волова Т.Г. Штамм бактерий Alcaligenes eutrophus В5786 - продуцент. Патент РФ № 2053292.1996.
  19. Волова Т.Г., Гительзон И.И., Кузнецов Б.Н., Калачева Г.С., Шабанов В.Ф. Способ получения полимера р-оксимасляной кислоты» Патент РФ № 2207375. 2003.
  20. Войнов Н.А., Еременко Н.А. Пленочный аппарат. Патент РФ № 2260466. Бюлл. Изобретений 2005: 26.
  21. Торговая марка «БИОПЛАСТОТАН» Регистрационное свидетельство № 315652 Федерального института патентной экспертизы по заявке № 2006703271/50, приоритет от 15.02.2006. Классы МКТУ: 01,05,10.
  22. Волова Т.Г. Биосинтез на водороде. Новосибирск: Сибирское отделение РАН; 2004.
  23. Volova T.G. Microbial polyhydroxyalkanoates - plastic materials of the 21st century (biosynthesis, properties, applications). USA (NY): Nova Science Publishers Inc; 2004.
  24. Шабанов В.Ф., Кузнецов Б.Н., Щипко М.Л. и др. Фундаментальные основы комплексной переработки углей КАТЭК для получения энергии, синтез- газа и новых материалов с заданными свойствами. Новосибирск: Наука; 2005.
  25. Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И. Полиоксиалканоаты- биоразрушаемые полимеры для медицины. Красноярск: Платина; 2006.
  26. Севастьянов И.И., редактор. Биосовместимость. М: ИЦ ВНИИгеосистем; 1999.
  27. Thomson R.C., Mikos A.G., Beahm E. et al. Guided tissue fabrication from periosteum using preformed biodegradable polymer scaffolds. Biomaterials 1999; 20: 2007-18.
  28. Kim S., Park H., Han J., et al. Renal tissue reconstitution by the implantation of renal segments on biodegradable polymer scaffolds. Biotechnol. Lett. 2003; 25: 1505-8.
  29. Hu Y., Winn S.R., Krajbich I. et al. Porous polymer scaffolds surface modified with arginine-glycine-aspartic acid enhance bone cell attachment and differentiation in vitro. J. Biomed. Mater. Res. 2003; 64A: 583-90.
  30. Шишацкая Е.И., Еремеев А.В., Гительзон И.И. и др. Исследование цитотоксичности полиоксиалканоатов в культуре животных клеток. ДАН РАН 2000; 374: 561-4.
  31. Севастьянов В.И., Перова Н.В., Довжик И.А. и др. Медико-биологические свойства полиоксиалканоатов - биодеградируемых бактериальных полимеров. Перспективные материалы 2001; 5: 46-55.
  32. Шишацкая Е.И., Есимбекова Е.Н., Волова Т.Г. и др. Гигиеническая оценка полиоксиалканоатов - природных полиэфиров нового поколения. Гигиена и санитария 2002; 4: 59-63.
  33. Шишацкая Е.И., Волова Т.Г., Попова Т.Г. Исследование токсикологических свойств полиоксиалканоатов в хроническом эксперименте in vivo. Мед. техника 2002; 4: 29-32.
  34. Шишацкая Е.И., Волова Т.Г., Ефремов С.Н. и др. Реакция тканей на биодеградируемые шовные нити из полиоксиалканоатов. Мед. техника 2002; 4: 23-6.
  35. Шишацкая Е.И. Медико-биологические свойства биодеградируемых бактериальных полимеров полиоксиалканоатов для искусственных органов и клеточной трансплантологии: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М; 2003.
  36. Volova T.G., Shishatskaya E.I., Sevastianov V.I. et al. Results of biomedical investigations of PHB and PHB/PHV fibers. Biochemical Eng. J. 2003; 16:125-33.
  37. Sevastianov V.I., Perovа N.V., Shishatskaya E.I. et al. Production of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2003; 14:1029-42.
  38. Shishatskaya E.I., Volova T.G., Efremov S.N. et al. Tissue response to the implantation of biodegradable polyhydroxyalkanoate sutures. J. Mater. Sci.: Materials in medicine 2004; 15: 719-28.
  39. Shishatskaya E.I., Volova T.G. A comparative investigation of biodegradable polyhydroxyalkanoate films as matrices for in vitro cell cultures. J. Mater. Sci.: Materials in Medicine 2004; 15: 915-23.
  40. Шишацкая Е.И., Волова Т.Г., Гордеев С.А. и др. Биодеградация шовных нитей на основе полиоксиалканоатов в биологических средах. Перспективные материалы 2002; 2: 56-62.
  41. Shishatskaya E.I., Volova T.G., Gordeev S.A. et al. Degradation of P(3HB) and P(3HB-co-3HV) in biological media. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2005; 16: 643-57.
  42. Петраковская Э.А., Волова Т.Г., Иванов Ю.Н. и др. Исследование структурных и динамических особенностей твердого полиоксибутирата методами магнитного резонанса. ДАН РАН 1995; 344: 270-3.
  43. Волова Т.Г., Некрасов Ю.П., Шишацкая Е.И. и др. Характеристика изделий на основе полиоксиалканоатов - разрушаемых природных полиэфиров. Пластические массы 2003; 3: 6-8.
  44. Shishatskaya E.I., Chlusov I.A., Volova T.G. A hybrid PHA-hydroxyapatite composite for biomedical application: production and investigation. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2006; 17: 481-98.
  45. Шишацкая Е.И. Биосовместимые и функциональные свойства гибридного композита полигидроксибутират/гидроксиапатит. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2006; 3:34-8.
  46. Волова Т.Г., Шишацкая Е.И., Гордеев С.А. Характеристика ультратонких волокон, полученных электростатическим формованием термопластичного полиэфира (поли(гидроксибутирата/гидросивалерата)). Перспективные материалы 2006; 3: 25-9.
  47. Шишацкая Е.И., Горева А. Микрочастицы из биорарушаемого полиоксибутирата в качестве матрикса для депонирования рубомицина. Перспективные материалы 2006; 4:65-70.
  48. Tesema Y., Raghavan D., Stubbs J. Bone cell viability on collagen immobilizated poly(3- hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) membrane effect of surface chemistry. J. Appl. Polym. Sci. 2004; 93: 2445-53.
  49. Grondahl L., Chandler-Temple A., Trau M. Polymeric Grafting of Acrylic Acid onto poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate): Surface Functionalization for Tissue Engineering Application. Biomacromol. 2005; 6: 2197-203.
  50. Egorova V.A., Nemets E.A., Krasheninnikov M.E. et al. Matrix on the basis of polyhydroxybutyrate copolymers for bioartificial tissues. In: Proceedings of Advanced Research Workshop (NATO Science Program) on Macromolecular Approaches to Advanced Biomaterials Engineering Systems; 2003 Nov 8-11; Sofia, Bulgaria. 2003:15.
  51. Севастьянов В.И., Егорова В.А., Немец Е.А. и др. Биодеградируемый биополимерный материал ЭластоПОБФ для клеточной трансплантации. Перспективные материалы 2004; 3: 35-41.
  52. Севастьянов В.И., Егорова В.А., Немец Е.А. и др. Медико-биологические свойства биодеградируемого материала ЭластоПОБФ. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2004; 2: 47-52.
  53. Расулов М.Ф., Севастьянов В.И., Егорова В.А. и др. Сравнительное изучение динамики заживления глубоких ожоговых ран при использовании аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, иммобилизированных на биодеградируемых мембранах или снятых с культурального пластика. Патологич. физиол. и эксперим. терапия 2005; 2:20-3.
  54. Потапов И.В., Ильинский И.М., Севастьянов В.И. и др. Пленочные системы ЭластоПОБ с иммобилизованными стромальными клетками костного мозга оптимизируют регенерацию поврежденных тканей. Клеточные технологии в биологии и медицине 2005; 3: 151-57.
  55. Tezcaner A., Bugra K., Hasirci V. Retinal pigment epithelium cell culture on surface modified poly(xydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) thin films. Biomaterials 2003; 24: 4573-83.
  56. Степанов Е.И. Лазерная резка полимерных поверхностей. Дипломная работа бакалавра. Красноярский гополитехнический университет. 2005.
  57. Шишацкая Е.И., Гордеев С.А., Волова Т.Г. Исследование свойств полигидроксиалканоатов, перспективных для получения пористых матриц. Перспективные материалы 2004; 5: 40-4.
  58. Шишацкая Е.И., Горева А.Ю., Войнова О.Н. и др. Реакция тканей на имплантацию микрочастиц из резорбируемых полимеров при внутримышечном введении. Бюлл. эксперим. биологии и медицины 2007 (принята в печать).
  59. Jones N., Cooper J., Waters R. et al. Resorption profile and biological response of calcium phosphate filled PLLA and PHB7V. In: Agrawal C.M., Pacr J.E., Lin S.T., editors. Synthetic Bioabsorbable Polymers for Implants. Scranton: ASTM; 2000: 69-82.
  60. Hasirci V. Biodegradable biomedical polymers. In: Wise D.L., editor. Biomaterials and Bioengineering Handbook. New-York: Marcel Dekker; 2000:141-155.
  61. Turesin F., Gursel I., Hasirci V. Biodegradable polyhydroxyalkanoate implants for osteomyelitis therapy: in vitro antibiotic release. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2001; 12: 195-207.

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
2. Fig. 1

下载 (312KB)
3. Fig. 2

下载 (253KB)
4. Fig. 3

下载 (240KB)
5. Fig. 4

下载 (214KB)

版权所有 © Eco-Vector, 2023



СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: 
##common.cookie##