MicroRNAs in the regulation of osteogenesis in vitro and in vivo: from fundamental mechanisms to bone diseases pathogenesis

全文:

Введение За два последних десятилетия появилось много сведений о значимой роли молекул микрорНК в регуляции генов при реализации программ остеогенной дифференцировки. Многочисленные исследования in vitro на культурах остеогенных предшественников и in vivo в модельных системах, как в норме, так и при различной патологии, вносят значимый вклад в понимание фундаментальных процессов остеогенной дифференцировки и могут быть использованы для разработки новых способов диагностики и лечения тяжелых заболеваний, связанных с нарушением формирования или регенерации костной ткани, таких как остеопороз, несовершенный остеогенез, клейдокраниальная дисплазия и др. Механизм рНК-интерференции, открытый в 1998 г. [1], обеспечивает сайленсинг (замалчивание) генов на посттранскрипционном этапе экспрессии при помощи регуляторных некодирующих малых молекул рНК, таких как piРНК (piwi-interacting RNA), siРНК (small interfering RNA), rasiРНК (repeat associated small interfering RNA) и микрорНК. МикрорНК являются эндогенными двухцепочечными молекулами рНК длинной 18-25 нуклеотидов, экспрессирующимися в ядерном геноме. МикрорНК кодируются как отдельными генами, так и целыми кластерами. Последовательность микрорНК может находиться в интроне, некодирующей мрНК области экзона кодирующего белок гена или межгенном участке рядом с геном, с которого транскрибируется ее целевая мрНК [2, 3]. Молекулы микрорНК, пройдя необходимые стадии «созревания», связываются с З'-нетранслируемой областью (3'-UTR) мрНК-мишеней в цитоплазме клетки, вызывая их деградацию, деаденилирование или ингибирование трансляции [4] (рис. 1). Обычно последовательность микрорНК комплементарна только небольшому участку целевой мрНК. Так называемая "seed”-последовательность на 5'-конце молекулы микрорНК, состоящая из 2-8 нуклеотидов, распознает уникальную последовательность 3'-UTR ее целевой мрНК [2, 5]. Явление неполной комплементарности позволяет одной молекуле микрорНК распознавать ряд транс-криптов мрНК с одного или нескольких генов [6]. Молекулы микрорНК для научно-исследовательских целей или возможной терапии могут быть синтезированы деградация мРНК рис. 1. Биогенез и механизм действия микрорНК Гены & Клетки Том XIV, № 1, 2019 42 ОБЗОРЫ Рис. 2. Участие молекул микроРНК в реализации WNT/p-катенин и BMP/SMAD сигнальных путей при остеогенной дифференцировке in vitro. такие молекулы, используемые для усиления действия (сверхэкспрессии) исследуемых микрорНК, называются микрорНК-мимиками, а применяемые в качестве антагонистов, вызывающих деградацию микрорНК, - анти-микрорНК или антагомирами. Сигнальные пути остеогенной дифференцировки Индукция остеогенной дифференцировки может осуществляться с помощью нескольких сигнальных путей, наиболее хорошо изученными из которых являются Bone morphogenetic protein (BMP)/Small mothers against decapentaplegic (SMAD) и Wingless/Integrated (WNT)/p-катенин канонические пути. Передача сигналов по этим путям активирует экспрессию двух ключевых транскрипционных факторов программ остеогенной дифференцировки: Runt-related transcription factor 2 (Runx2) и Osterix (Osx) [7]. Сигнальный путь BMP-2/SMAD Cвязывание внеклеточных лигандов семейства BMP с рецепторами Bone morphogenetic protein receptor (BMPR) инициирует их киназную активность, обеспечивая фосфорилирование сигнальных молекул SMAD1/5/8 и их связывание со SMAD4. образовавшийся комплекс транслоцируется в ядро и инициирует экспрессию гена Runx2. В свою очередь, Runx2 стимулирует экспрессию более позднего маркера остеогенной дифференцировки - гена Osterix, совместно с которым осуществляется регуляция генов-маркеров, находящихся ниже в генном каскаде - Alkaline phosphatase (ALP), Bone sialoprotein (BSP), Osteocalcin (OCN), Osteopontin (OPN), Collagen type 1 (COL1) и др. [7]. SMAD6/7 выступают отрицательными регуляторными молекулами, контролируя синтез Runx2 через E3-убиквитинлигазы Smurf1 и Smurf2, вызывая его про-теосомную деградацию [8, 9]. Сигнальный путь WNT/p-катенин р-катенин является ключевой сигнальной молекулой канонического пути WNT/p-катенин. В отсутствие сигналов от внеклеточных лигандов WNT цитоплазматический р-катенин связан с комплексом деградации, состоящим из Casein kinase 1 (CK1), Axin, Glycogen synthase kinase-3p (GSK3p) и др. GSK3p и CK1 фосфо-рилируют р-катенин [10], после чего он подвергается убиквитинированию и последующей протеасомной деградации [11]. При взаимодействии внеклеточных лигандов WNT с трансмембранными рецепторами Frizzled (FZD) и Low density lipoprotein receptor-related protein (LRP), происходит активация цитоплазматического белка Dishevelled (DSH), который вместе с рецептором LRP связывается с комплексом деградации, вызывая его инактивацию. В результате прекращается фосфо-рилирование и деградация р-катенина, он накапливается в цитоплазме и транслоцируется в ядро, где в комплексе с транскрипционными факторами T-cell factor/lymphoid enhancer factor (TCF/LEF) активирует экспрессию гена Runx2 [12]. Лиганды Dickkopf-related protein 1 и 2 (DKK1, DKK2), Kremen2, Secreted frizzled related protein 2 (sFRP2), Sclerostin (SOST) и др. препятствуют связыванию белков WNT с рецепторами на поверхности клетки, предотвращая образование комплекса Frizzled/WNT/LRP и, таким образом, выступают негативными регуляторами WNT/p-катенин сигнального пути [13-15]. Гены & Клетки Том XIV, № 1, 2019 ОБЗОРЫ 43 Регуляция экспрессии ключевых транскрипционных факторов остеогенеза В регуляции экспрессии гена Runx2 участвуют члены семейства Homeobox protein (Hox) белков, способные инициировать или репрессировать его активность. Muscle segment homeobox 2 (Msx2) активно экспрессируется в преостеобластах и подавляет транскрипционную активность Runx2. Уровень Distal-less homeobox 3/5 (Dlx3/5) возрастает на более поздних стадиях остеогенной диф-ференцировки, предотвращая ингибирующее воздействие Msx2, и активирует экспрессию гена Runx2. Кроме того, Msx2 и Dlx5 положительно регулируют экспрессию Osx с помощью независимого от Runx2 механизма [7, 16]. Special AT-rich sequence-binding protein 2 (SATB2) - белок ядерного матрикса, который ингибирует экспрессию Hoxa2 - отрицательного регулятора экспрессии Runx2 [17]. транскрипционный регулятор Hoxa10 принимает участие в активации экспрессии Runx2, а также генов ALP, OCN и BSP независимо от Runx2 [18]. Участие микроРНК в регуляции остеогенеза in vitro и in vivo МикрорНК участвуют в позитивной и негативной регуляции дифференцировки клеток костного диффе-рона посредством воздействия на различные гены, вовлеченные в пути реализации программ остеогенеза. МикрорНК участвуют во всех этапах передачи сигнала, воздействуя на мрНК лигандов, рецепторов, сигнальных молекул и регуляторов транскрипции (рис. 2). BMP/SMAD сигнальный путь Лиганды сигнального пути BMP/SMAD. В муль-типотентных мезенхимальных стромальных клетках человека (mesenchymal stem cells, MSC, ММсК) из различных источников найдены молекулы микроРНК-93^, микроРНК-106b-5p и микроРНК-140-5p, а в клетках линии остеобластов мыши MC3T3-E1 - микрорНК-370, нацеленные на 3'-UTR мрНК BMP-2, сверхэкспрессия которых ингибирует остеогенную дифференцировку [1922]. Подавление функции микрорНК-542-3р, мишенью которой является BMP-7, способствует экспрессии остеогенных генов-маркеров, увеличению активности Alp и минерализации внеклеточного матрикса (ВКМ) в остеобластах мыши, а у мышей с овариопорозом увеличивает объем костной ткани [23]. Сверхэкспрессия микрорНК-378, распознающей 3'-UTR мрНК BMP-4, препятствует развитию остеогенной дифференцировки в клетках линии миобластов мыши С2С12 [24]. Таким образом, микрорНК-93-5р, микроR-106b-5p, микрорНК-140-5р, микрорНК-370, микрорНК-378 и микрорНК-542-3р оказывают негативное влияние на остеогенную дифференцировку, снижая количество внеклеточных лигандов группы BMP. Рецепторы сигнального пути BMP/SMAD. Сверхэкспрессия микрорНК-125Ь, одним из целевых генов которой является 3'-UTR мрНК BMPR1B, снижает активность Alp и экспрессию Ocn в культурах ММСК костного мозга мыши mBMSC и ST2 при BMP-4-опосредованной остеогенной дифференцировке [25]. В культурах ММсК жировой ткани человека hADSC и hBMSCs сверхэкспрессия ориентированных на BMPR2 микрорНК-100 и микрорНК-153, соответственно, также негативно влияет на реализацию остеогенного потенциала [26, 27]. МикрорНК-100, микрорНК-153 и микрорНК-125b препятствуют образованию рецепторов BMP, снижая восприимчивость клеток к действию лигандов-агонистов, и таким образом ингибируют остеогенную дифференцировку. Сигнальные молекулы пути BMP/SMAD. Область 3'-UTR мрНК Smad1 является мишенью микрорНК-26a при остеогенной дифференцировке клеток в культуре ADSCs [28] и членов семейства микрорНК-30, играющих роль в подавлении остеогенеза in vitro в клетках линии остеобластов мыши MC3T3-E1 [29]. В процессе BMP-2-опосредованной дифференцировки клеток линий С2С12 и MC3T3 значительно снижается экспрессия микрорНК-135, микрорНК-106b-5p и микрорНК-17-5p, нацеленных на 3'-UTR мрНК Smad5. сверхэкспрессия данных молекул ингибирует остеогенную дифференцировку in vitro [30, 31]. Деградация микрорНК-106b-5p и микрорНК-17-5p у мышей в модели ложной овариэктомии увеличивает формирование костной ткани и приводит к улучшению трабекулярной микроархитектуры кости [31]. SMAD5 является одной из мишеней микрорНК-21. Уровень белка SMAD5 возрастает при остеогенной дифференцировке клеток культуры hPDLSC, полученной из периодонтальной связки человека, а сверхэкспрессия микрорНК-21 подавляет остеогенез в этой культуре [32]. Та же молекула микрорНК-21 оказывает противоположное действие, усиливая остеогенез в клетках MC3T3-E1, и участвует в ингибировании трансляции Smad7, но не деградирует ее мрНК [33]. Показано, что при BMP-2-опосредованной дифферен-цировке SMAD7 является целью также для микрорНК-590-5p. При трансфекции клеточных культур hBMSC данными молекулами увеличивается минерализация ВКМ и экспрессия генов ALP и COL1 [8]. таргетирующие внутриклеточные сигнальные молекулы SMAD1/5 микрорНК-135, микроРНК-106b-5p и микрорНК-17-5p ингибируют остеогенную дифференцировку, а микроРНК-590^, приводящая к деградации SMAD7, усиливает остеогенез in vitro. МикрорНК-21 вызывает противоположные эффекты в различных культурах, воздействуя на мрНК генов-мишеней SMAD5 и SMAD7. WNT/p-катенин сигнальный путь Лиганды сигнального пути WNT/в-катенин. сверхэкспрессия микрорНК-410, связывающейся с 3'-UTR мрНК WNT3a, снижает уровень белка WNT3a и увеличивает транскрипцию и трансляцию хондро-генных маркеров: Collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), Sex-determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9), Aggrecan (ACAN) и Hyaluronan synthase 2 (HAS2) в культурах hBMSC [34]. МикрорНК-410 способствует хондроген-ной дифференцировке и является негативным регулятором остеогенеза. Экспрессия микроРНК-29a в культурах остеобластов человека повышается при остеогенной дифферен-цировке. Сверхэкспрессия микроРНК-29a снижает уровень белков-лигандов DKK1, Kremen2 и sFRP2, способствуя передаче сигнала по пути Wnt/p-катенин. Генами-мишенями данной микроРНК являются Dkk1, Kremen2 и sFRP2 [13]. Уровень микроРНК-218, нацеленной на Dkk2, sFRP2 и Sost, повышается при дифференцировке mBMSC [15]. В культурах hASC сверхэкспрессия микроРНК-218 увеличивает продукцию ALP, RUNX2, BSP и OCN, а ингибирование данной молекулы подавляет остеогенез [14]. При этом показано, что экспрессия микроРНК-29a индуцируется факторами, задействованными в Wnt/p-катенин сигнальном пути. Таким образом, наблюдается положительная взаимная регуляция: молекулы микроРНК-29a и микроРНК-218 потен-циируют Wnt/p-катенин-сигналинг, который в свою очередь индуцирует транскрипцию данных молекул [13, 14]. Гены & Клетки Том XIV, № 1, 2019 44 оБЗорЫ DKK1 также является мишенью для микроРНК-335-5p, сверхэкспрессия которой увеличивает фосфорилирова-ние GSK3P и повышает уровень р-катенина, способствуя передаче сигналов по пути Wnt/p-катенин [35]. МикрорНК-29э, микрорНК-218 и микрорНК-335-5p, ингибирующие внеклеточные отрицательные регуляторы сигнального пути Wnt/p-катенин, действуют как индукторы остеогенеза. Рецепторы сигнального пути WNT/fi-катенин. Ингибирование молекул микрорНК-139^ в культурах hBMSC усиливает остеогенную дифференцировку, повышая экспрессию генов ALP, RUNX2, COL1 и OCN [36]. МикрорНК-139-5p деградирует мрНК рецептора FZD4 и тем самым ингибирует остеогенную дифференцировку. рецептор этого же семейства FZD1 является мишенью микрорНК-204, также оказывающей негативное влияние на остеогенез in vitro [37]. Экспрессия микрорНК-23а, ориентированной на мрНК рецептора LRP5, снижается при остеогенной дифференцировке клеток в культуре hBMSCs, а ингибирование данной молекулы способствует остеогенезу in vitro [38]. В клетках линии мышиных остеобластов MC3T3-E1 сверхэкспрессия микрорНК-375^, нацеленной на LRP5 и р-катенин, приводит к резкому снижению экспрессии гена Runx2 и повышает уровень белка-лиганда Sost, ингибируя остеогенную дифферен-цировку [39]. МикрорНК-4739 также подавляет остеогенез и стимулирует адипогенез в культурах hBMSC, таргетируя LRP3 [40]. Таким образом, микрорНК-23а, микрорНК-139-5p, микрорНК-204, микрорНК-375^ и микрорНК-4739 ингибируют WNT-опосредованную остеогенную диффе-ренцировку, предотвращая формирование рецепторного комплекса FZD/LRP. МикрорНК-4739 является регуляторной молекулой, задействованной в переключении программы дифференцировки между адипогенезом и остеогенезом. Сигнальные молекулы пути WNT/fi-катенин. При остеогенной дифференцировке клеток в культуре hBMMSC экспрессия микрорНК-150-3p и микрорНК-496, индуцированная цитокинами TNF-a и IL-1 р, соответственно, понижает уровень р-катенина и маркеров остеогенеза, а также уменьшает минерализацию ВКМ. Мишенью данных микрорНК является 3'-UTR мрНК р-катенина [41, 42]. С этим же транскриптом связывается микрорНК-139-5p, сверхэкспрессия которой ингибирует остеогенную диффе-ренцировку hBMSC [36]. МикрорНК-139-5p, микрорНК-496 и микрорНК-150-3p, деградирующие мрНК р-катенина, ингибируют остеогенную дифференцировку hBMSC, при этом микрорНК-496 и микроРнК-150-3p могут участвовать в регуляции остеогенеза при воспалении. Сверхэкспрессия микрорНК-26э и микрорНК-346 способствует Wnt-опосредованной остеогенной дифференцировке клеток в культуре hBMSC, увеличивая экспрессию р-катенина, его накопление в ядре, а также экспрессию генов Cyclin D1, c-Myc, TCF-1 и LEF-1. Целью микрорНК-26э и микрорНК-346 является 3'-UTR мрНК GSK3P [43, 44]. Следовательно, микрорНК-26а и микрорНК-346 стимулируют остеогенную дифференцировку, подавляя трансляцию GSK3p. При этом, как было сказано выше, в ММСК, полученных из жировой ткани мыши, микрорНК-26э ингибирует остеогенную дифференцировку, таргетируя Smad1, тем самым подавляя сигнальный путь BMP [28]. Таким образом, одна и та же молекула микрорНК-26а выполняет различную функцию в зависимости от тканевой принадлежности клеток. МикрорНК-1 7-5p, мишенью которой является SMAD7, способствует ядерной транслокации р-катенина, повышению экспрессии COL1A1, и в результате приводит к пролиферации и остеогенной дифференцировке клеток hBMSC [45]. МикрорНК, нацеленные на негативные регуляторы остеогенеза GSK3P и SMAD7, способствуют остеогенезу в культурах hBMSC. регуляторы экспрессии ключевых транскрипционных факторов остеогенеза Были найдены 11 микрорНК, таргетирующие 3'-UTR мрНК Runx2 и негативно регулирующие остеогенную дифференцировку в клетках различных мышиных линий: микрорНК-23э, микрорНК-30а микрорНК-34а микрорНК-133a, микрорНК-135a, микрорНК-137, микрорНК-204, микрорНК-205, микрорНК-217, микрорНК-218 и микрорНК-338. При этом в клетках линии MC3T3-E1 микрорНК-218, вероятно, связывается и с другими мишенями, умеренно увеличивая уровень белка Runx2 [46]. На клетках той же линии подтверждено участие членов семейства микрорНК-30 (a, b, c и d) в отрицательной регуляции BMP-2-опосредованной остеогенной дифференцировке путем таргетирования Runx2, а также Smad1 [29]. Ингибирующее действие микрорНК-133, также ориентированной на Runx2, при BMP-индуцированном сигналинге показано на клеточных линиях C2C12 и MC3T3 [30]. При остеогенной диффе-ренцировке остеобластов линии hFOB 1.19, индуцированной циклическим механическим растяжением (CMS), снижается экспрессия микрорНК-103, непосредственно нацеленной на мрНК гена RUNX2, а ее ингибирование увеличивает уровень белка RUNX2. роль механочувстви-тельной микрорНК-103 в подавлении остеогенеза была подтверждена in vivo [47]. ранее было показано участие данной молекулы в активации адипогенеза in vitro: эктопическая экспрессия микрорНК-103 способствовала дифференцировке адипоцитов, увеличивая экспрессию маркера адипогенеза Peroxisome proliferator-activated receptor у2 (PPARy2) [48]. Также в выборе пути между адипогенной и остеогенной дифференцировкой участвуют микрорНК-204, микрорНК-211, микрорНК-705 и микроРНК-3077-5p, мишенью которых является RUNX2. Уровень экспрессии этих молекул обратно пропорционален количеству белка RUNX2 в культурах BMSC. Данные микрорНК опосредуют коммитирование культур BMSC в направлении адипогенеза [49, 50]. Наконец, найдена еще одна микрорНК, также таргетирующая RUNX2, микрорНК-335, подавляющая пролиферацию, миграцию, а также остеогенный и адипогенный потенциалы hBMSC [51]. Таким образом, выявлен большой пул микрорНК, геном-мишенью которой является RUNX2. Все обнаруженные молекулы подавляют остеогенную диффе-ренцировку, а некоторые играют важную роль в переключении путей между остеогенезом и адипогенезом in vitro. МикрорНК-31 активно экспрессируется в клетках линии остеосаркомы человека MG63s [52], а в культурах rBMSCs экспрессия этой молекулы постепенно снижается во время остеогенной дифференцировки [53]. Ингибирование микрорНК-31 приводит к увеличению уровня белков OSX и OCN в этих клетках [52, 53]. Сверхэкспрессия микрорНК-31 в культуре BMSCs значительно уменьшает экспрессию остеогенных маркеров OPN, BSP, OSX и OCN, но не транскрипционного фактора Runx2. Выявлено, что микрорНК-31 ингибирует экспрессию OSX, связываясь с его мрНК [54]. Также OSX является мишенью для микрорНК-143 [55], микрорНК-145 [56] и микрорНК-214 [57], которые подавляют остеогенную Гены & Клетки Том XIV, № 1, 2019 оБЗорЫ 45 дифференцировку в клеточных линиях С2С12 и MC3T3-E1. При этом воздействие микроРНК-145 на культуры хондроцитов человека вызывает снижение экспрессии генов внеклеточного матрикса хряща - COL2A1 и ACAN и повышение экспрессии RUNX2. Было показано, что прямой мишенью микроРНК-145 является Sox9 - ключевой транскрипционный фактор хондрогенеза [58]. Позднее была обнаружена обратная связь между экспрессией микроРНК-145 и PpARy - маркера адипоге-неза. Показано, что промотор гена PPARj имеет сайты связывания для микроРНК-145, а трансфекция мимиками микроРНК-145 повышает уровень мРНК PPARy [59]. Нацеленная на тот же транскрипт микроРНК-637, участвует в регуляции как остеогенной, так и адипогенной дифференцировки, являясь переключателем данных программ [60]. сверхэкспрессия молекулы микроРНК-93, таргетирующей Osx в остеобластах мыши, останавливает остеогенную дифференцировку во время минерализации остеоидного матрикса, снижая экспрессию белка Osx, и не влияя на уровень ее мРНК. Сверхэкспрессия Osx уменьшает транскрипцию микроРНК-93, тогда как блокирование его экспрессии усиливает транскрипцию данной молекулы [61]. МикроРНК-31, микроРНК-93, микроРНК-143, микроРНК-145 и микроРНК-637, ингибирующие активность гена OSX, играют важную роль в регуляции не только остеогенеза, а также адипо- и хондрогенеза. Экспрессия микроРНК-141 и микроРНК-200a снижается во время ранней BMP-2-индуцированной остеогенной дифференцировки, а сверхэкспрессия этих молекул значительно ингибирует данный процесс, снижая экспрессию остеогенных маркеров и активность ALP. Общей мишенью этих молекул является мРНК Dlx5 [62]. Экспрессия ориентированной на тот же транскрипт микроРНК-124а снижается при BMP-4-опосредованном остеогенезе в культуре плюрипотентных клеток мыши [63]. Транскрипт гена HOXA10 является прямой мишенью микроРНК-320a, микроРНК-705 и микроРНК-3077-5p [50, 64]. Сверхэкспрессия микроРНК-320a значительно подавляет остеогенез, вызывая снижение экспрессии H0XA10, RUNX2, ALP и OC, минерализации ВКМ и ингибирование активности ALP в клеточной культуре hBMSC, тогда как ингибирование микроРНК-320a имеет противоположные эффекты [64]. МикроРНК-34Ь и микроРнК-34c ингибируют пролиферацию остеобластов, подавляя накопление Cyclin D1, Cyclin-dependent kinase 4 и 6 (Cdk4 и Cdk6), и блокируют их терминальную дифференцировку, деградируя мРНК белка-лиганда Satb2 в культуре первичных остеобластов мыши [65]. Анализ in vivo показал, что микроРНК-34Ь и микроРНК-34c подавляют дифференцировку и пролиферацию остеобластов, снижая костную массу, но не вызывая резорбцию кости, что подчеркивает важность этих молекул в процессах развития и регенерации костной ткани [65]. Сверхэкспрессия микроРНК-31 и микроРНК-205 ингибирует остеогенную дифференцировку в культурах hMSC и rBMSC, соответственно. Обе молекулы также нацелены на SATB2 и их воздействие зависит от уровня SATB2 [66, 67]. Экспрессия микроРНК-24, связывающейся с 3'-UTR Tcf-1, снижается во время остеогенной дифференцировки mBMSCs и клеток линии MC3T3-E1. Сверхэкспрессия данной молекулы значительно ингибирует остеогенную дифференцировку. В клетках остеосаркомы SaOS-2 геном-мишенью микроРНК-24 является TCF-3 [68, 69]. В культуре ST2, полученной из костного мозга мыши, было обнаружено, что микроРНК-2861 и микроРНК-3960 транскрибируются вместе с одного полицистрона и способствуют BMP-2-индуцированной остеогенной дифференцировке, увеличивая экспрессию Runx2. Их генами-мишенями являются ингибиторы Runx2: Histone deacetylase 5 (HDAC5) - для микроРНК-2861 и HOXA2 - для микроРНК-3960. Показано, что сверхэкспрессия Runx2 индуцирует транскрипцию микроРНК-2861 и микроРНК-3960, а нокдаун Runx2, напротив, ослабляет транскрипцию микроРНК-2861 и микроРНК-3960 [70, 71]. таким образом, выявлено большое число микроРНК, мишенями которых являются факторы, принимающие непосредственное участие в регуляции транскрипции при остеогенной дифференцировке, инициированной BMP/SMAD и WNT/p-катенин сигнальными путями. участие микрорнк в развитии заболеваний костной ткани Остеопороз У пожилых пациентов с частыми переломами, свидетельствующими о развитии остеопороза (ОП), в образцах бедренных костей было обнаружено повышение уровня микроРНК-214, а в сыворотке крови - микроРНК-96, нацеленных на ген OSX [72, 73]. В in vivo моделях ОП, вызванного овариоэктомией и(или) снижением нагрузки на заднюю конечность, увеличение объема и плотности костной ткани наблюдались при подавлении функций микроРНК-103a, микроРНК-705, микроРНК-3077^ (мишень - мРНК гена Runx2), микроРНК-542^ (мишень - мРНК гена BMP-7), микроРНК-106b-5p и микроРНК-17-5p (мишень - мРНК гена Smad5), а также при повышении уровня микроРНК-21 (мишень - мРНК гена Spry1) [23, 31, 47, 50, 74]. В культурах hBMSC, полученных из костного мозга бедренной кости, предплечья или позвоночника пациентов с ОП, ингибирование микроРНК-96, усиливало остеогенную дифференцировку [73]. Экспериментальные данные свидетельствуют о важной роли микроРНК-17-5p, микроРНК-96, микроРНК-103a, микроРНК-106b-5p, микроРНК-214, микроРНК-542^, микроРНК-705 и микроРНК-3077^ в патогенезе ОП. Ингибирование активности данных молекул может быть потенциальной терапевтической стратегией для улучшения состояния больных ОП, а сами молекулы могут рассматриваться как биомаркеры заболевания [23, 31, 47, 50, 72, 73]. Несовершенный остеогенез В сыворотке крови пациентов с несовершенным остеогенезом (НО) было обнаружено повышение уровня микроРНК-21, микроРНК-26a, микроРНК-30є и снижение количества микроРНК-29a, микроРНК-29b, микроРНК-34а микроРНК-133a, микроРНК-145, микроРНК-210, микроРНК-489 и микроРНК-1297 [75]. Участие микроРНК-145, мишенью которой является OSX, в развитии НО было подтверждено позднее на культурах остеобластов пациентов с НО: наблюдалось уменьшение уровня микроРНК-145 и экспрессии RUNX2. При трансфекции культур мимиками микроРНК-145 возрастали уровни OSX, RUNX2, TCF-1 и р-катенина, подтверждая участие микроРНК-145 в активации сигнального пути WNT [76]. В клеточных культурах hBMSC, полученных из костного мозга гребня подвздошной кости от пациентов с НО, было зафиксировано снижение экспрессии COL1A1 и микроРнК-29Ь. Предполагается, что активация транскрипции микроРНК-29Ь зависит от количества мРНК COL1A1, и низкий уровень экспрессии COL1A1 у пациентов с НО недостаточен для индукции микроРНК-29b [77]. таким образом, для пациентов с НО может быть актуальна терапия, направленная на увеличение экспрессии определенных микроРНК. Гены & Клетки Том XIV, № 1, 2019 46 ОБЗОрЫ Клейдокраниальная дисплазия В культурах клеток, выделенных из зубных фолликулов (DFC) пациентов с клейдокраниальной дисплазией (ККД), было обнаружено повышение экспрессии 69 микрорНК и снижение уровня 54 микрорНК (в числе которых микроРНК-23Ь, микроРНК-93, микроРНК-204, микроРНК-214, микроРНК-218) [78]. В клеточной культуре DFCs, полученной из зубных фолликулов пациента с мутацией p.634T>G,p.T212P в гене RUNX2, при остеогенной дифференцировке был повышен уровень микрорНК-31 (ориентированной на SATB2 и OSX) и снижена экспрессия генов RUNX2 и SATB2. Эндогенный нокдаун микрорНК-31 приводил к увеличению экспрессии SATB2 и RUNX2 [79]. Перекрестное ингибирование между экспрессией гена RUNX2 и микроРНК может быть одним из ключевых регуляторных механизмов диффе-ренцировки DFC при ККД и являться причиной задержки прорезывания зубов у пациентов. При трансфекции клеток линий LS8 и MC3T3-E1 векторами, несущими ген RUNX2 с одной из трех точечных мутаций - R190W13x, R225Q14 и A362V4, зафиксировано увеличение экспрессии микроРНК-185-5p, нацеленной на ген Dlx2. Сверхэкспрессия данной молекулы снижала экспрессию Alp при остеогенной дифференцировки клеток линии MC3T3-E1. Таким образом, было показано, что точечные мутации в гене Runx2 при ККД индуцируют экспрессию микроРНК, выполняющей роль отрицательного регулятора остеогенеза [80]. Поиск регуляторных молекул, задействованных в патогенезе ККД, является важным шагом на пути к эффективной терапии этих заболеваний. Нетравматический остеонекроз В культурах hBMSC, полученных их костного мозга проксимального отдела бедренной кости пациентов с нетравматическим остеонекрозом, был значительно снижен уровень экспрессии микроРНК-17-bp, связывающейся с транскриптом гена SMAD7. Ингибирование микроРНК-17-5p усиливало пролиферацию и остеогенную дифференцировку клеток hBMSC. Предполагается, что нарушение взаимодействий микроРНК-17-5p, SMAD7 и р-катенина, может способствовать патогенезу нетравматического остеонекроза [45]. заключение В настоящее время обнаружено много молекул микроРНК, участвующих в регуляции остеогенной дифференцировки на всех ее этапах от взаимодействия лигандов сигнальных путей с рецепторами до транскрипции. В зависимости от мишени, микрорНК могут являться как негативными регуляторами остеогенеза, так и инициировать этот процесс. Выявлены молекулы, выступающие в роли триггерных переключателей при выборе судьбы мультипотентных предшественников - дифференцировке в клетки костной, хрящевой или жировой ткани. Обнаружено изменение уровня экспрессии целого ряда микрорНК у пациентов с различными заболеваниями костной ткани, что может служить ключом к расшифровке патогенетических механизмов развития этих состояний и являться значимым диагностическим биомаркером при постановке диагноза. Подходы, направленные на увеличение или уменьшение количества аномально-экспрессирующихся микроРНК, могут быть использованы в терапевтических стратегиях для многих заболеваний. Эффективность применения таких потенциальных терапевтических приемов, основанных на подавлении функций микрорНК путем введения анти-микроРНК, уже показана в in vivo моделях остеопо-роза и других заболеваний костной ткани. Кроме того, в настоящее время проводится ряд клинических исследований I или II фазы с использованием анти-микрорНК или микроРНК-мимик для терапии гепатита С, диабета II типа и ряда онкологических заболеваний [81], что обозначает тенденцию к применению данных стратегий в клинической практике. Следует отметить, что залогом успеха разрабатываемых терапевтических методов является применение безопасных и эффективных способов доставки анти-микроРНК в клетки. Используемые в настоящее время липофильные и поликатионные трансфицирующие агенты обладают недостаточной эффективностью, а вирусные методы доставки небезопасны, что требует их серьезной доработки для широкого применения в клинической практике. разработка и модификация систем доставки анти-микроРНК в сочетании с новыми данными о роли микроРНК в патогенезе заболеваний костной ткани может привести к разработке современных терапевтических платформ для эффективного лечения тяжелых инвалидизирующих дегенеративно-дистрофических заболеваний костей.

作者简介

E. Galitsyna

Research Centre for Medical Genetics

T. Bukharova

Research Centre for Medical Genetics

A. Vasilyev

Research Centre for Medical Genetics; Central Research Institute of Dental and Maxillofacial Surgery, Ministry of Health of the Russian Federation

D. Goldshtein

Research Centre for Medical Genetics; M.V. Lomonosov Moscow State University

参考

补充文件