Экспансионная микроскопия для визуализации кластеров белков в культивируемых клетках и тканях головного мозга
- Авторы: Раковская А.В.1, Чигряй М.Е.1, Пчицкая Е.И.1, Безпрозванный И.Б.1,2
-
Учреждения:
- Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого
- Юго-Западный медицинский центр Техасского университета
- Выпуск: Том 18, № 4 (2023)
- Страницы: 536-539
- Раздел: Материалы конференции
- Статья получена: 13.11.2023
- Статья одобрена: 18.11.2023
- Статья опубликована: 15.12.2023
- URL: https://genescells.ru/2313-1829/article/view/623257
- DOI: https://doi.org/10.17816/gc623257
- ID: 623257
Цитировать
Полный текст
Открытый доступ
Доступ предоставлен
Доступ платный или только для подписчиков
Аннотация
Многие биологические исследования требуют получения изображений с высоким разрешением для последующего анализа клеточных органелл и молекул. Экспансионная микроскопия (ЭМ) позволяет достичь нанометрового разрешения с помощью обычного флуоресцентного микроскопа за счёт физического расширения исследуемого образца в геле в несколько раз. В данной работе при использовании ЭМ проанализированы белковые кластеры, образованные кальций-связывающим белком STIM1 (stromal interacting molecule) и проницаемыми для кальция каналами IP3R (рецептор инозитолтрифосфата). Сенсор кальция эндоплазматического ретикулума (ЭР) STIM1 перемещается к контактам ЭР с плазматической мембраной, где он образует кластеры, чтобы активировать депо-управляемый вход кальция (ДУВК) после падения концентрации кальция в ЭР [1]. Одним из преимуществ экспансионной микроскопии является то, что образец расширяется по трём осям, включая ось Z, поэтому можно обнаружить премембранные белки без помощи TIRF-микроскопии. Известно, что STIM1 взаимодействует с end-binding белком 1 (EB1), расположенным на плюс-концах микротрубочек, который регулирует ДУВК. В данной работе представлен количественный метод анализа кластеров белков на примере STIM1 и его мутантной формы STIM1-TR/NN, не связывающейся с ЕВ-белками, с использованием метода экспансионной микроскопии.
Инозитол-1,4,5-трифосфатные рецепторы (IP3R) являются основными каналами высвобождения Ca2+ из ЭР в цитоплазму. Ранее было показано, что в эндотелиальных клетках IP3-рецептор аналогично белкам STIM взаимодействует с белком ЕВ через SxIP аминокислотный мотив, и это регулирует его кластеризацию и кальциевую сигнализацию [2]. В гиппокампальных нейронах IP3-рецептор 1 типа также формирует кластеры, необходимые для эффективного выхода кальция через канал в ответ на стимул. Для изучения роли изоформы 1 рецептора IP3 в функционировании головного мозга были проанализированы кластеры IP3R у мышей дикого типа и мышей 5xFAD, моделирующих болезнь Альцгеймера (БА), поскольку известно, что этот рецептор характеризуется повышенной активностью во время этого патологического состояния [3].
Для анализа кластеризации белков STIM1 клетки HEK293T с конфлюэнтностью 50–70% трансфицировались плазмидами mCherry-STIM1 и mCherry-STIM1-TR/NN. Клетки фиксировались и окрашивались первичными антителами к белку mCherry и вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором Alexa Fluor 594, для усиления интенсивности флуоресценции. На следующем этапе клетки подвергались процедуре изотропного расширения в геле с помощью экспансионной микроскопии. Метод экспансионной микроскопии проводился так, как описано в [4]. Образец расширялся путём двукратного добавления бидистиллированной воды на 20 минут.
Для анализа кластеризации белков IP3R были получены фронтальные срезы толщиной 50 мкм мозга двух групп мышей: контрольной и 5xFAD (мышиная модель болезни Альцгеймера). После иммуногистохимического окрашивания срезов мозга первичным антителами IP3R1 и вторичными Alexa Fluor 488 был применён протокол экспансионной микроскопии [4]. Для обработки изображений использовалось программное обеспечение ImageJ и Icy. При помощи ImageJ была определена яркость каждого нейрона, и в зависимости от данного параметра было сформировано три группы нейронов с тремя типами уровней интенсивности флуоресценции. В зависимости от уровня использовался определённый порог бинаризации в Adaptive3DThreshold. Подход деления на группы позволил нивелировать влияние на анализ различий в интенсивность флуоресценции, наблюдаемой вследствие различия в степени экспрессии белка IP3R.
Анализ результатов продемонстрировал, в соответствии с литературными данными, что при разрыве связи с тубулиновыми микротрубочками STIM1 больше агрегирует при опустошении кальциевого депо по сравнению с его нормальным вариантом STIM1 [5]. В результате оценки морфометрических параметров кластеров IP3R при сравнении трансгенных мышей с контрольной группой получены следующие результаты: в группе с наибольшей интенсивностью нейронов и группе с наибольшей и средней интенсивностью нейронов наблюдалось увеличение размера и количество кластеров белка IP3R у мышей линии 5xFAD. Для валидации полученных результатов применялся метод вестерн-блот, полученные данные также продемонстрировали гиперэспрессию белка IP3R у мышей линии 5xFAD. Таким образом, впервые показано, что кластеры белка IP3R больше агрегируют на мышиной модели БА, что согласуется с литературными данными о высокой активности IP3R при БА [3].
Ключевые слова
Полный текст
Многие биологические исследования требуют получения изображений с высоким разрешением для последующего анализа клеточных органелл и молекул. Экспансионная микроскопия (ЭМ) позволяет достичь нанометрового разрешения с помощью обычного флуоресцентного микроскопа за счёт физического расширения исследуемого образца в геле в несколько раз. В данной работе при использовании ЭМ проанализированы белковые кластеры, образованные кальций-связывающим белком STIM1 (stromal interacting molecule) и проницаемыми для кальция каналами IP3R (рецептор инозитолтрифосфата). Сенсор кальция эндоплазматического ретикулума (ЭР) STIM1 перемещается к контактам ЭР с плазматической мембраной, где он образует кластеры, чтобы активировать депо-управляемый вход кальция (ДУВК) после падения концентрации кальция в ЭР [1]. Одним из преимуществ экспансионной микроскопии является то, что образец расширяется по трём осям, включая ось Z, поэтому можно обнаружить премембранные белки без помощи TIRF-микроскопии. Известно, что STIM1 взаимодействует с end-binding белком 1 (EB1), расположенным на плюс-концах микротрубочек, который регулирует ДУВК. В данной работе представлен количественный метод анализа кластеров белков на примере STIM1 и его мутантной формы STIM1-TR/NN, не связывающейся с ЕВ-белками, с использованием метода экспансионной микроскопии.
Инозитол-1,4,5-трифосфатные рецепторы (IP3R) являются основными каналами высвобождения Ca2+ из ЭР в цитоплазму. Ранее было показано, что в эндотелиальных клетках IP3-рецептор аналогично белкам STIM взаимодействует с белком ЕВ через SxIP аминокислотный мотив, и это регулирует его кластеризацию и кальциевую сигнализацию [2]. В гиппокампальных нейронах IP3-рецептор 1 типа также формирует кластеры, необходимые для эффективного выхода кальция через канал в ответ на стимул. Для изучения роли изоформы 1 рецептора IP3 в функционировании головного мозга были проанализированы кластеры IP3R у мышей дикого типа и мышей 5xFAD, моделирующих болезнь Альцгеймера (БА), поскольку известно, что этот рецептор характеризуется повышенной активностью во время этого патологического состояния [3].
Для анализа кластеризации белков STIM1 клетки HEK293T с конфлюэнтностью 50–70% трансфицировались плазмидами mCherry-STIM1 и mCherry-STIM1-TR/NN. Клетки фиксировались и окрашивались первичными антителами к белку mCherry и вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором Alexa Fluor 594, для усиления интенсивности флуоресценции. На следующем этапе клетки подвергались процедуре изотропного расширения в геле с помощью экспансионной микроскопии. Метод экспансионной микроскопии проводился так, как описано в [4]. Образец расширялся путём двукратного добавления бидистиллированной воды на 20 минут.
Для анализа кластеризации белков IP3R были получены фронтальные срезы толщиной 50 мкм мозга двух групп мышей: контрольной и 5xFAD (мышиная модель болезни Альцгеймера). После иммуногистохимического окрашивания срезов мозга первичным антителами IP3R1 и вторичными Alexa Fluor 488 был применён протокол экспансионной микроскопии [4]. Для обработки изображений использовалось программное обеспечение ImageJ и Icy. При помощи ImageJ была определена яркость каждого нейрона, и в зависимости от данного параметра было сформировано три группы нейронов с тремя типами уровней интенсивности флуоресценции. В зависимости от уровня использовался определённый порог бинаризации в Adaptive3DThreshold. Подход деления на группы позволил нивелировать влияние на анализ различий в интенсивность флуоресценции, наблюдаемой вследствие различия в степени экспрессии белка IP3R.
Анализ результатов продемонстрировал, в соответствии с литературными данными, что при разрыве связи с тубулиновыми микротрубочками STIM1 больше агрегирует при опустошении кальциевого депо по сравнению с его нормальным вариантом STIM1 [5]. В результате оценки морфометрических параметров кластеров IP3R при сравнении трансгенных мышей с контрольной группой получены следующие результаты: в группе с наибольшей интенсивностью нейронов и группе с наибольшей и средней интенсивностью нейронов наблюдалось увеличение размера и количество кластеров белка IP3R у мышей линии 5xFAD. Для валидации полученных результатов применялся метод вестерн-блот, полученные данные также продемонстрировали гиперэспрессию белка IP3R у мышей линии 5xFAD. Таким образом, впервые показано, что кластеры белка IP3R больше агрегируют на мышиной модели БА, что согласуется с литературными данными о высокой активности IP3R при БА [3].
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Источник финансирования. Поддержано РНФ № 21-74-00028 (ЕП).
Об авторах
А. В. Раковская
Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого
Автор, ответственный за переписку.
Email: rakovskaya.av@edu.spbstu.ru
Россия, Санкт-Петербург
М. Е. Чигряй
Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого
Email: rakovskaya.av@edu.spbstu.ru
Россия, Санкт-Петербург
Е. И. Пчицкая
Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого
Email: rakovskaya.av@edu.spbstu.ru
Россия, Санкт-Петербург
И. Б. Безпрозванный
Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого; Юго-Западный медицинский центр Техасского университета
Email: rakovskaya.av@edu.spbstu.ru
Россия, Санкт-Петербург; Даллас, США
Список литературы
- Liou J., Fivaz M., Inoue T., Meyer T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2007. Vol. 104, N 22. P. 9301–9306. doi: 10.1073/pnas.0702866104
- Geyer M., Huang F., Sun Y., et al. Microtubule-Associated Protein EB3 Regulates IP3 Receptor Clustering and Ca(2+) Signaling in Endothelial Cells // Cell Reports. 2015. Vol. 12, N 1. P. 79–89. doi: 10.1016/j.celrep.2015.06.001
- Egorova P.A., Bezprozvanny I.B. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptors and neurodegenerative disorders // FEBS Journal. 2018. Vol. 285, N 19. P. 3547–3565. doi: 10.1111/febs.14366
- Wassie A.T., Zhao Y., Boyden E.S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research // Nature Methods. 2019. Vol. 16, N 1. P. 33–41. doi: 10.1038/s41592-018-0219-4
- Chang C.L., Chen Y.J., Quintanilla C.G., et al. EB1 binding restricts STIM1 translocation to ER-PM junctions and regulates store-operated Ca2+ entry // Journal of Cell Biology. 2018. Vol. 217, N 6. P. 2047–2058. doi: 10.1083/jcb.201711151
Дополнительные файлы
