Induction of neural differentiation of adipose stromal cells
- Autores: Lopatina T.V.1, Kalinina N.l.1, Revischin A.V.2, Beme A.A.1, Spirova I.A.1, Pavlova G.V.2, Parfenova E.V.3
-
Afiliações:
- Lomonosov Moscow State University
- RAS Institute of Gene Biology
- Cardiology Research Center
- Edição: Volume 3, Nº 4 (2008)
- Páginas: 50-54
- Seção: Original Study Articles
- ##submission.dateSubmitted##: 09.02.2023
- ##submission.dateAccepted##: 09.02.2023
- ##submission.datePublished##: 12.02.2023
- URL: https://genescells.ru/2313-1829/article/view/208541
- ID: 208541
Citar
Texto integral
Resumo
Adipose stromal cells (ASCs) are progenitor cells capable to differentiate into a large variety of cell types including neuronal cells. Many active ingredients were suggested for the induction of neural differentiation of stromal progenitor cells. However the combination of pharmaceutically approved agents allowing stable induction of neural differentiation of ASCs is not established. Here, we tested the ability of brain derived neurotrophic factor (BDNF) and retinoic acid (RA) alone as well as together with DNA demethylating agent 5-azacytidine to induce stable neural differentiation of ASCs. ASCs were isolated from human or mouse (BI6 strain) sub cutis as described by Zuk et al. At passages 2—5 the cells were induced with NIM (DMEM/F12, 3% FBS and 1 mcM azacytidine supplemented with ImcM RA or 20ng/ml BDNF) for 3 days. The efficiency of neural differentiation was estimated by the change of expression of neuronal markers, including nest in, tubuiin-beta3, neuron-specific enolase 2 and microtubule- associated protein 2, at 3 and 7 days after induction using Real Time PCR. The expression of marker genes increased Б-10 times after incubation in the NIM, supplemented with RA, and up to 4 times in the medium containing BDNF 3 days after induction. Furthermore, ASCs primed to neural differentiation demonstrate significantly better surviving and incorporation in the brain tissue after transplantation into the mouse brain. Taken together, our data suggest that the combination of BDNF or RA with 5-azacytidine could be suggested for the induction of stable neural transdifferentiation.
Palavras-chave
Texto integral
Введение
Отрома жировой ткани содержит малодифференцированные клетки-предшественницы, которые по своему фенотипу и экспрессионному профилю сходны с мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга [1]. Стромальные клетки-предшественницы из жировой ткани (СКЖТ) под действием различных индукторов способны дифференцироваться in vitro в различные типы клеток: остеобласты, хондробласты, адипоциты [2], гепатоциты, эндотелиальные клетки [3], миобласты [4], кардиомиоциты [5], эпителиальные клетки [6], а также нейральные предшественники [7]. В частности, нейральную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток можно индуцировать с помощью ретиноевой кислоты [8] и нейротрофических факторов [9, 10]. Однако способность СКЖТ воспринимать сигналынейротрофических факторов остается невыясненной. Кроме того, до сих пор не было предложено оптимального способа индукции нейральной дифференцировки СКЖТ in vitro.
В данной работе проведен сравнительный анализ эффективности нейральной дифференцировки под действием различных индукторов, как по ранее опубликованным [2], так и по разработанным нами протоколам, основанным на использовании ретиноевой кислоты и BDNF в сочетании с 5-азацитидином — химическим соединением, вызывающим деметилирование ДНК. BDNF способен активировать пролиферацию нейральных стволовых клеток и их дифференцировку [11]. Ретиноевая кислота активирует транскрипцию генов, участвующих в регуляции нейральной дифференцировки, посредством взаимодействия с ядерными рецепторами.
Материал и методы
Выделение стромальных клеток из жировой ткани
СКЖТ были выделены по протоколу Р.А. Zuk et al. [12]. Подкожная жировая клетчатка человека была получена при полостных операциях у неонкологических больных, средний возраст которых составлял 40—60 лет. СКЖТ мыши были выделены из подкожного жира паховой области самцов линии Black/6. Жировую ткань измельчали ножницами, затем обрабатывали коллагеназой («Invitrogen», США, 30 ед. на мл ткани) и протеазой («Gibco», США, 200 ед. на мл ткани) в течение 40 мин при 37°С при постоянном перемешивании. Затем в суспензию добавляли равный объем среды DMEM («Gibco», США) с 10% фетальной сыворотки коров (FBS, «Gibco», США) и центрифугировали 5—10 мин при 900 оборотах в минуту. Осадок, в котором находилась фракция стромально-васкулярных клеток, ресуспендировали в DMEM с 10% FBS и фильтровали через 100-мм клеточный фильтр (BD Biosciences, Bedford, МА). Далее клетки высаживали на культуральные чашки Петри («Costar Corning», США) и помещали в С02-инкубатор при 37°С и 5% С02. Fla следующий день в чашках меняли среду. Таким образом, в культуре оставались только прикрепившиеся клетки. После образования монослоя клетки снимали трипсином и рассевали в соотношении 1:2.
Окрашивание клеток и проточная цитометрия
СКЖТ были охарактеризованы по наличию антигенов CD34 (Dako, # С7238), c-kit (Dako, # R7145), CD73 (BD, # 550257), CD105 (Serotec, # MCA1557). Клеточную суспензию (0,5—1x10® клеток) первичной культуры и второго пассажа в 500 µl PBS буфера (phosphate buffered saline) инкубировали с первичными антителами в течение 40 мин. После трехкратной отмывки в PBS клетки инкубировали с вторичными антителами. Флуоресценция клеток была оценена методом проточной цитометрии на приборе MoFlo (Dako Cytomation, Дания) и проанализирована с помощью программы Summit 4.1. Изотипический контроль присутствовал в каждом эксперименте, и специфичность окрашивания была подтверждена сравнением флуоресценции между контролем и специфическими антителами. Всего для определения наличия антигена анализировали более 300 000 клеток.
Индукция нейральной дифференцировки
После 2-го пассажа СКЖТ переносили в 6-луночную плату и заливали средой DMEM с 10% FBS. Через сутки среду заменяли на DMEM/F12 с 3% FBS и добавляли индукторы (табл. 1).
Таблица 1. Индукторы нейральной дифференцировки
1. | 5-азацитидин (1 μМ), «Sigma», США |
2. | β-меркаптоэтанол (1 μМ), «Helicon», Россия |
3. | BDNF (20 ng/ml), «PeproTech», США |
4. | GDNF (20 ng/ml), «Clontech», США |
5. | IBMX (500 μМ), «Sigma», США |
6. | Ретиноевая кислота (1 μМ), «Sigma», США |
7. | Кондиционированная среда с нейральных стволовых клеток |
8. | 5-азацитидин (1 mM) + BDNF (20 ng/ml) |
9. | 5-азацитидин (1 μМ) + GDNF (20 ng/ml) |
10. | 5-азацитидин (1 μМ) + ретиноевая кислота (1 μМ) |
11. | 5-азацитидин (1 μМ) + BDNF (20 ng/ml), GDNF (20 ng/ml), ретиноевая кислота (1 μМ) |
Анализ изменения транскрипции генов
Через 3 сут. после индукции из клеток выделяли суммарную PFIK («RNeasy Mini Kit», «QIAGEN», США). Затем синтезировали кДНК согласно стандартному протоколу фирмы «Fermentas», используя олиго-dT-праймеры. Анализ дифференциальной экспрессии генов проводили методом ПЦР в реальном времени с применением Sybr Green («Синтол», Россия). Используемые в работе праймеры представлены в табл. 2.
Таблица 2. Сиквенс праймеров
Название праймера | Последовательность | f°C отжига праймеров | Длина продукта (п.н.) |
B-actin for | CCTGGCACCCAGCACAAT | 60 | 144 |
B-actin rev | GGGCCGGACTCGTCATAC | 60 | 144 |
Gapdh for | TGCACCACCAACTGCTTAGC | 60 | 87 |
Gapgh rev | GGCATGGACTGTGGTCATGAG | 60 | 87 |
TUBB for | GCCAGACGCGCCCAGTATGAGG | 64,4 | 232 |
TUBB rev | GGTTCCGGGTTCCAGGTCCAC | 61,1 | 232 |
MAP-2 for | CAACAG G AATT G ACT CCCT CTAC | 60 | 80 |
MAP-2 rev | TCACCAGGCTTACTTTGCTTC | 60,2 | 80 |
Eno-2 for | CCACCGCCACCGCCACTACCA | 66,4 | 162 |
Eno-2 rev | GCACTGCAGCCCGGAAAAGACC | 63,6 | 162 |
Nestin for | GCAGCTGGCGCACCTCAAGATGTC | 65,7 | 225 |
Nestin rev | GGCAAGGGTGAGGGGAGGGAAGTT | 65,1 | 225 |
GFAP for | CACCGCAGCCCTGAAAGAGA | 57,6 | 172 |
GFAP rev | CTGGCGCCGGTAGTCGTT | 55,9 | 172 |
Иммунофлуоресцентное окрашивание индуцированных СКЖТ
Для анализа индукции дифференцировки на белковом уровне СКЖТ 2-го пассажа переносили в 8-луночные стеклянные платы (Lab-Tek Chamber Slide, Nalge Nunc Int.) и на следующий день вносили индукторы. Через 3 сут. индуцирующую среду меняли на свежую, также содержащую соответствующие индукторы, культивировали еще 4 сут., после чего фиксировали в 4% растворе формальдегида 2 мин при комнатной температуре с последующей 3-х кратной отмывкой PBS. После отмывки клетки обрабатывали 1% раствором БСА [бычий сывороточный альбумин] с 10% козьей сыворотки в течение 30 мин, затем в течение 1 часа инкубировали при комнатной температуре в растворе кроличьих антител против нестина (Chemicon, США, 1:100), Eno2 (Chemicon, США, 1:50] и мышиных против тубулина (Abeam, 1:100]. В качестве отрицательного контроля использовался 1% раствор БСА с 10% козьей сывороткой. После отмывки в PBS клетки в течение 30 мин инкубировали в растворе PBS с флуоресцентными вторичными козьими антителами (1:100) против иммуноглобулина мыши (Alexa 488, Molecular Probes, США) или против иммуноглобулина кролика (Alexa 568, Molecular Probes, США).
Статистический анализ
Статистический анализ данных проводился с использованием программы SigmaStat 9.0. Для сравнения маленьких групп и ненормальных распределений использовался U-критерий Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при уровне значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение
Характеристика первичной культуры СКЖТ
Исходная популяция стромально-васкулярных клеток жировой ткани гетерогенна. На основании анализа экспрессии маркерных антигенов на поверхности этих клеток можно утверждать, что в этой популяции содержатся стволовые клетки, сходные по антигенному профилю с мезенхимальными и гемопоэтическими клетками-предшественницами [13—15]. После выделения из ткани культивируемые СКЖТ образовывали монослой фибробластоподобных клеток. Через 8—9 сут. культивирования определяли соотношение мезенхимальных и гемопоэтических кпеток-предшественниц в этой популяции, □казалось, что популяция клеток 2-го пассажа содержит около 98% клеток, имеющих фенотип мезенхимальных клеток-предшественниц, содержащих антигены CD73 и CD105. Несмотря на то, что в первичной культуре СКЖТ большинство клеток, несущих антиген CD73, экспрессировали также маркерный антиген гемопоэтических стволовых клеток CD34, на клетках 2 пассажа экспрессия этого антигена практически была нулевая. Это согласуется с ранее опубликованными данными о том, что экспрессия мембранного гликопротеида CD34 на клетках снижается по мере их культивирования. Что касается маркера гемопоэтических стволовых клеток с- kit, то в популяции СКЖТ 2 пассажа обнаружено около 1% клеток, несущих этот антиген. Доля клеток, содержащих c-kit, не изменилась по сравнению с популяцией свежевыделенных СКЖТ. Эти данные свидетельствуют о способности гемопоэтических предшественников к самоподцержанию в составе популяции.
Проверка эффективности различных индукторов дифференцировки
Нейральная дифференцировка клеток сопровождается повышением экспрессии специфичных генов. В частности, клетки, дифференцирующиеся в нейральном направлении, содержат белок цитоскелета нестин (маркер ранних нейральных предшественников), нейрональную форму βЗ-тубулина, глиальный кислый фибриллярный белок GFAP (маркер астроцитарной глии), белок, взаимодействующий с микротрубочками МАР2, специфичную для нейронов енолазу Епо2 и другие маркеры нейральной дифференцировки.
Нами было проанализировано содержание продуктов, перечисленных выше, маркерных генов нейральной дифференцировки в СКЖТ, инкубированных в присутствии различных индукторов, включая IBMX, р-меркаптоэтанол, 5-азацитидин [2, 7, 16], а также нейротрофических факторов роста BDNF и GDNF (см. табл. 1). Продукт гена GFAP не определялся ни в контрольных СКЖТ, ни в клетках, инкубированных в присутствии индукторов, перечисленных в табл. 1. Анализ содержания мРНК других маркерных генов показал, что уровень экспрессии Eno2, МАР2, TUBB и Nestin был выше в клетках, инкубированных в присутствии ретиноевой кислоты или BDNF на фоне 5-азацитидина (табл. 3).
Таблица 3. Относительный уровень амплификации фрагментов маркерных генов в СКЖТ, индуцированных различными агентами
| Nestin | TUBB | Eno2 | MAP2 |
Control | 11,7 | 3,8 | 7,3 | 7,0 |
aza | 4,6 | 17,1 | 2,7 | 60,0 |
β-merc | 0,0 | 0,7 | 3,8 | 2,9 |
IBMX | 0,0 | 4,1 | 2,9 | 0,7 |
BDNF | 1,9 | 7,4 | 7,6 | 10,0 |
GDNF | 0,0 | 0,7 | 2,8 | 1,4 |
RA | 0,0 | 0,8 | 2,3 | 1,4 |
Cond. Media | 9,0 | 4,5 | 4,7 | 5,0 |
BDNF+aza | 60,4 | 10,2 | 300,3 | 170,0 |
GDNF+aza | 5,7 | 4,1 | 20,8 | 19,3 |
RA+aza | 262,1 | 137,8 | 48,7 | 6,2 |
BDNF, GDNF, RA+aza | 17,4 | 1,4 | 3,0 | 3,5 |
Примечание. Уровень амплификации находится в прямой зависимости от уровня мРНК генов в СКЖТ.
В СКЖТ, культивированных в присутствии других индукторов нейральной дифференцировки, увеличения уровня мРНК маркерных генов нейральной дифференцировки не наблюдалось (см. табл. 3).
Нa основании полученных результатов для индукции нейральной дифференцировки СКЖТ были выбраны ретиноевая кислота или BDNF в сочетании с 5-азацитидином. При индукции дифференцировки СКЖТ, полученных от 8 доноров, было установлено, что при культивировании клеток в присутствии ретиноевой кислоты в сочетании с 5-азацитидином в этих клетках возрастал уровень мРНК, нестина и тубулина. Индукция нейральной дифференцировки клеток с помощью BDNF в сочетании с 5-азацитидином вызывает увеличение экспрессии всех 4 проанализированных генов (табл. 4).
Таблица 4. Относительный уровень амплификации фрагментов маркерных генов в СКЖТ, индуцированных BDNF и RA на фоне 5-азацитидина
| Nestin | TUBB | Eno2 | MAP2 |
Control | 0,34 | 0,63 | 0,07 | 0,07 |
aza | 0,04 | 0,86 | 0,17 | 0,05 |
BDNF+aza | 1,02 | 1,64 | 2,09 | 2,11 |
RA+aza | 2,01 | 2,3 | 0,41 | 0,39 |
Примечание. Уровень амплификации находится в прямой зависимости от уровня мРНК генов в СКЖТ. Жирным шрифтом показаны увеличенные значения уровней экспрессий маркёрных генов.
Полученные данные были подтверждены с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания индуцированных клеток. Показано, что инкубация клеток с ретиноевой кислотой приводит к повышению содержания в них нестина и βЗ-тубулина, а в СКЖТ, культивированных в присутствии BDNF, возрастает содержание как нестина и βЗ-тубулина, так и специфичной для нейронов енолазы Епо2 (рис. 1).
Рис. 1. Содержание маркерных белков нейральной ифференцировки в стромальных клетках жировой ткани: Nestin - окрашивание антителами к нестину; NUBB - антителами к β3-тубулину; EN02 - к нейрональной енолазе; RA - культивирование в присутствии ретиноевой кислоты; BDNF - в присутствии мозг-производного нейротрофического фактора. ×250
Активация экспрессии генов Eno2, МАР2, TUBB и Nestin в СКЖТ, культивированных в присутствии BDNF или ретиноевой кислоты, может свидетельствовать об индукции нейральной дифференцировки этих клеток. Ретиноевая кислота в комплексе с белком CRABP входит в ядра клеток и взаимодействует с транскрипционным комплексом, который включает пару рецепторов ретиноевой кислоты RAR (retinoic acid receptor) и RXR (retinoic X receptor). По последним данным, ретиноевая кислота влияет на экспрессию около 530 генов, из них более 27 являются ее непосредственными мишенями. В частности, это гены транскрипционных факторов, таких как Hoxal, Н0ХА4, НохМ, Hoxb4, Hoxd4, Cdxl, и Pitl, которые принимают участие в регуляции эмбрионального развития [17]. BDNF — это нейротрофический фактор, контролирующий жизнеспособность, развитие и функционирование нервных клеток в центральной и периферической нервной системе [11].
Индуцированные мышиные СКЖТ способны встраиваться в ткань стриатума мыши
Для того чтобы проанализировать способность СКЖТ после индукции нейральной дифференцировки встраиваться в ткань мозга мыши, нами были использованы клетки самцов мышей линии Black/6, трансгенных по гену GFP. СКЖТ, содержащие зеленый флуоресцентный белок, культивировали в присутствии ретиноевой кислоты или BDNF в течение 3-х сут. Затем эти клетки были введены в стриатум мышей линии Black/б, не экспрессирующих белок GFP. Через 7, 9 и 11 сут. головной мозг извлекали, проводили анализ распределения трансплантированных клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. Уже через 9 сут. после инъекции были заметны различия в распределении контрольных и индуцированных клеток в ткани мозга. Так, контрольные клетки не контактировали с тканью реципиента и располагались исключительно в области трека, оставленного иглой. Напротив, СКЖТ, культивированные в присутствии индукторов, мигрировали в ткани мозга (рис. 2).
Рис. 2. GFP-положителычые стромальные клетки жировой ткани мыши через 9 сут. после трансплантации в головной мозг мыши. Контрольные клетки (верхняя панель) находятся в области трека, и их отделяет от мозговой ткани слой межклеточного вещества (на фотографии виден как черная прослойка между зелеными клетками и слабо аугофлуоресцирующей тканью мозга). Между клетками, индуцированными с помощью ретиноевой кислоты (RA) или BDNF, и тканью реципиента границы не формируются, клетки мигрируют из области введения в ткань мозга реципиента, ×80
Более того, через 11 дней после инъекции в стриатуме не обнаруживалось контрольных клеток, тогда как СКЖТ, индуцированные в нейральную дифференцировку, выживали в мозге мыши-реципиента.
Заключение
Обнаружено, что BDNF и ретиноевая кислота в сочетании с 5-азацитидином вызывают активацию экспрессии маркерных генов нейральной дифференцировки в СКЖТ. Однако использование этих факторов без 5-азацитидина оказалось малоэффективным. С помощью анализа увеличения транскрипции маркерных генов нами были подобраны эффективные индукторы нейральной дифференцировки СКЖТ. Выживаемость и способность индуцированных клеток к миграции была проверена in vivo с помощью трансплантации индуцированных мышиных СКЖТ, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок CGFP), в головной мозг мыши. Клетки, в которых была индуцирована нейральная дифференцировка, способны встраиваться в ткань мозга реципиента после трансплантации и сохранять жизнеспособность более 11 сут. после введения. Для того чтобы установить, какие пути внутриклеточной сигнализации опосредуют индуцирующее воздействие BDNF и ретиноевой кислоты на нейральную дифференцировку СКЖТ, необходимы дальнейшие исследования. Таким образом, трансплантация СКЖТ, в которых была индуцирована нейральная дифференцировка, может являться перспективным подходом для восстановления нервной ткани.
Sobre autores
T. Lopatina
Lomonosov Moscow State University
Autor responsável pela correspondência
Email: bozo.ilya@gmail.com
Rússia, Moscow
N. Kalinina
Lomonosov Moscow State University
Email: bozo.ilya@gmail.com
Rússia, Moscow
A. Revischin
RAS Institute of Gene Biology
Email: bozo.ilya@gmail.com
Rússia, Moscow
A. Beme
Lomonosov Moscow State University
Email: bozo.ilya@gmail.com
Rússia, Moscow
I. Spirova
Lomonosov Moscow State University
Email: bozo.ilya@gmail.com
Rússia, Moscow
G. Pavlova
RAS Institute of Gene Biology
Email: bozo.ilya@gmail.com
Rússia, Moscow
E. Parfenova
Cardiology Research Center
Email: bozo.ilya@gmail.com
Rússia, Moscow
Bibliografia
- Gronthos S., Franklin D.M., Leddy Н.А. et al. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J. Cell. Physiol. 2001; 189(1): 54-63.
- Ashjian P.H., Elbarbary A.S., Edmonds B. et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plast. Reconstr. Surg. 2003; 111(6): 1922-31.
- Seo M.J., Suh S.Y., Bae Y.C., Jung J.S. Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 328(1): 258—64.
- Mizuno H., Zuk P.A., Zhu M. et al. Myogenic differentiation by human processed lipoaspirate cells. Plast. Reconstr. Surg. 2002; 109(1): 199-211.
- Planat-Benard V., Menard C., Andre M. et al. Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells. Circ. Res. 2004; 94(2): 223-9.
- Brzoska M., Geiger H., Gauer S., Baer P. Epithelial differentiation of human adipose tissue-derived adult stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 330(1): 142-50.
- Fujimura J., Ogawa R., Mizuno H. et al. Neural differentiation of adipose-derived stem cells isolated from GFP transgenic mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 333(1): 116—21.
- Kim B.J., Seo J.H., Bubien J.K., Oh Y.S. Differentiation of adult bone marrow stem cells into neuroprogenitor cells in vitro. Neuroreport 2002; 13(9): 1185-8.
- Lim J.Y., Park S.I., Oh J.H. et al. Brain-derived neurotrophic factor stimulates the neural differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells and survival of differentiated cells through МАРК/ ERK and PI3K/Akt-dependent signaling pathways. J. Neurosci. Res. 2008 (in press).
- Rivera F.J., Sierralta W.D., Minguell J.J., Aigner L. Adult hippocampus derived soluble factors induce a neuronal-like phenotype in mesenchymal stem cells. Neurosci. Lett. 2006; 406(1-2): 49—54.
- Reichardt L.F. Neurotrophin-regulated signalling pathways. Philos. Trans. R Soc. Lond. В Biol. Sci. 2006; 361(1473): 1545-64.
- Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001; 7(2): 211-28.
- Miranville A., Heeschen C., Sengenes C. et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation 2004; 110(3): 349-55.
- Planat-Benard V., Silvestre J.S., Cousin B. et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation 2004; 109(5): 656—63.
- Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell 2002; 13(12): 4279—95.
- Ning H., Lin G., Lue T.F., Lin C.S. Neuron-like differentiation of adipose tissue-derived stromal cells and vascular smooth muscle cells. Differentiation 2006; 74(9-10): 510—8.
- Balmer J.E. Blomhoff R. Gene expression regulation by retinoic acid. J. Lipid Res. 2002; 43(11): 1773-808.
Arquivos suplementares
