Hypoderm reaction to material used in stomatology for tissue engineering

Texto integral

В последнее время в практике стоматологии и челюстнолицевой хирургии применяются синтетические материалы. В значительной степени результат лечения зависит от реакции тканей реципиентного ложа (пародонта) на используемый материал. Реактогенность, определяемая в современном биоматериаловедении как присущая биоматериалу способность вызывать определенную реакцию со стороны соприкасающихся с ним клеток и тканей [1], большей части материалов, используемых в стоматологии проверена рядом тестов, включая эксперименты in vitro. Однако, именно это свойство подлежит интегральной оценке и является основным критерием характеристики биоматериалов [1].

Разрабатываемые технологии тканевой инженерии основаны на сочетанной имплантации (графтинге) синтетического или природного носителя с различными клетками. Зачастую материалы из стоматологической имплантологии механически переносятся в практику тканевой инженерии. □писаны результаты экспериментов по использованию в качестве носителей-скаффолдов золота [2], нержавеющей стали [3], различных сплавов титана [4-6], пластмасс [7-10], как в виде монолитных имплантатов, так и в виде наноносителей, губок и волокон [6]. Вместе с тем, на сегодняшний день недостаточно морфологических данных, демонстрирующих реакцию тканей живого организма на данные материалы в «чистом виде», то есть об их реактогенности. Кроме того, разрабатываемые технологии повышения гистоинтегративных свойств материалов путем нанесения на их поверхность культур различных клеток [11] также нуждаются в подобного рода данных, так как культура in vitro не может в полной мере имитировать тканевые реакции.

Цель настоящего исследования состояла в описании реакции тканей лабораторных животных - белых крыс - на имплантацию материалов, которые могут быть использованы в дальнейшем как носители для клеток в тканевой инженерии.

Материал и методы

Исследование проведено на белых беспородных крысах (Rattus) массой 150-200 гр. Всего в эксперименте было использовано 78 беспородных крыс, которые были разделены на 6 групп (по количеству изученных видов металлов и пластмасс), а также на 2 группы контроля (отбираемых методикой случайной выборки). В первой контрольной группе животным под наркозом проводили разрез кожи и подкожной соединительной ткани, который затем ушивали. Вторая группа - интактные крысы. Образцы тестируемых материалов помещали в подкожную соединительную ткань поясничной области. Животных выводили из опыта с помощью ингаляции хлороформа, в сроки 7, 14, 21-е сутки и 1 месяц после имплантации.

Для исследования забирали тканевый материал, окружавший образец. Для светооптического исследования материал маркировали и фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин, изготавливали срезы толщиной 7-10 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином, по методам Ван-Гизона, Маллори.

Для электронномикроскопического исследования (трансмиссионная электронная микроскопия, ТЭМ) материал забирался у одной из крыс в каждой группе на всех сроках исследования. Кусочки помещали в 2,5% глютаровый диальдегид при рН=7,4. После промывки буфером, дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия на 0,1 М какодилатном буфере 1,5 часа. После обезвоживания в спиртах, контрастирования 1,5% уранил-ацетатом, материал пропитывали в смоле и заливали в аралдит по обычной схеме. Для предварительной оценки повреждений и выбора необходимого участка использовались полутонкие срезы толщиной 1 мкм, которые окрашивали 1% раствором толуидинового синего, а также трехцветной окраской. Ультратонкие срезы толщиной 20-40 нм получали на ультратомах LKB-4 и LKB-5, контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца. Просмотр и фотосъемку ультратонких срезов проводили на электронном микроскопе JEM-100 CX.

Результаты исследования и их обсуждение

Реакция тканей на имплантацию металлов

Золото

При макроскопическом исследовании на 7-е сутки после установки имплантатов вокруг образцов из золота определялась тонкая и нежная соединительнотканная капсула. Микроскопическое исследование материала, окружающего образцы в первой группе, показало, что через 1 неделю проба золота была окружена тонким слоем фибрина, к которому прилежит волокнистая соединительная ткань без признаков воспаления (рис. 1А). Через две недели фибрин практически отсутствовал, к образцу непосредственно прилегали волокна рыхлой соединительной ткани с единичными макрофагами, располагавшимися среди волокон.

 

Рис. 1. Реакция тканей гиподермы на имплантацию металлов через 7 сутки: А - имплантат из золота. Место имплантата окружено тонким слоем фибрина. Рыхлая соединительная ткань включает коллагеновые волокна и единичные эритроциты; В — имплантат из нержавеющей стали, с покрытием нитридом титана. Место имплантата окружено массивным слоем фибрина. В толще фибрина - выраженная макрофагальная инфильтрация. Полутонкий срез. Трёхцветная окраска. х630

 

Через 3 недели проба золота была окружена тонким слоем волокнистой соединительной ткани, представленной преимущественно коллагеновыми волокнами без признаков воспаления. К концу месяца пробы золота окружала тонкая капсула из зрелой волокнистой соединительной ткани без признаков воспалительной инфильтрации.

Сталь

Через неделю вокруг пробы из нержавеющей стали наблюдался значительный слой фибрина с умеренно выраженной лейкоцитарной и макрофагальной инфильтрацией, а также небольшими включениями окислов металла. В отличие от этих проб, образцы из стали, покрытой нитридом титана, были окружены массивным слоем фибрина, инфильтрированного лимфоцитами и макрофагами (рис. 1 В, 2А). В окружающей молодой соединительной ткани с большим количеством мелких новообразованных сосудов имела место значительная воспалительная инфильтрация.

 

Рис. 2. Реакция тканей гиподермы на имплантацию нержавеющей стали: А — активный макрофаг, 7 суток после имплантации. Цитоплазма переполнена гранулами, содержащими продукты переработки фагоцитированного материала. ТЭМ. х15000; В — сосуд из прилегающей соединительной ткани: пролиферация и набухание эндотелия сосудов. В просвете сосуда - склеенные между собой эритроциты. Вокруг сосуда - клетки мононуклеарного ряда. Полутонкий срез. Трёхцветная окраска. х1000

 

Через две недели вокруг пробы сохранялся небольшой слой фибрина с некоторой воспалительной, но уже преимущественно макрофагальной инфильтрацией и присоединялась значительная воспалительная реакция сосудов, проявлявшаяся пролиферацией эндотелия, периваскулярной мононуклеарной инфильтрацией (рис. 2В). Спустя 3 недели проба из нержавеющей стали была окружена небольшим слоем созревающей грануляционной ткани с незначительной лимфоцитарной инфильтрацией.

Через месяц пробы металла были окружены зрелой волокнистой соединительной тканью с небольшим количеством макрофагов, часть которых содержала окислы железа и лимфоциты.

Имплантат из нержавеющей стали, с покрытием нитрида титана через неделю был окружён массивным слоем фибрина с выраженной макрофагальной и очаговой сегментоядерной инфильтрацией. Вокруг проб из нержавеющей стали с покрытием нитридом титана через 7 дней образовывалась капсула из фибрина, окруженная молодой соединительной тканью, содержащей макрофаги с окислами металлов, причем как слой фибрина, так и представительство макрофагов были выражены сильнее, чем вокруг пробы стали без покрытия (см. рис. 1 В).

Через две недели вокруг пробы сохранялся массивный слой фибрина, а в окружающей соединительной ткани наблюдалась значительная лейкоцитарная инфильтрация и появлялись макрофаги, содержащие окислы металла. Через 21 день проба была окружена рыхлой волокнистой соединительной тканью с небольшим количеством тонкостенных сосудов, заполненных эритроцитами и единичными сегментоядерными лейкоцитами (рис. 3). На некотором расстоянии от пробы среди волокнистой соединительной ткани располагается большое количество макрофагов, некоторые из них загружены окислами металлов.

 

Рис. 3. Соединительнотканная капсула, окружающая имплантат из нержавеющей стали, с покрытием нитридом титана. Отдельные макрофаги содержат незначительное количество пигмента. Окраска по Ван-Гизону. х400

 

Через месяц проба была окружена зрелой волокнистой соединительной тканью со значительным количеством мононуклеарных клеток, содержащих окислы металла (рис. 4) и толстыми пучками коллагеновых волокон, идущих в различных направлениях.

 

Рис. 4. Макрофаг, переполненный продуктами распада фагоцитированного материала из соединительной ткани, окружающей имплантат из нержавеющей стали с покрытием нитридом титана. 1 месяц. ТЭМ. '15000

 

Реакция тканей на имплантацию пластмасс

На 14-е сутки во всех наблюдениях с имплантацией этакрила проба была окружена созревающей грануляционной тканью. Непосредственно к пластмассе прилежала лишь узкая полоска ткани с массивной лимфо-макрофагальной инфильтрацией. За ней располагалась молодая соединительная ткань с очаговыми воспалительными инфильтратами и гранулемами «инородных тел» с гигантскими многоядерными клетками вокруг мелких фрагментов пластмассы.

Пробы фторакса через неделю были окружены капсулой, состоящей из соединительной ткани с большим количеством сосудов со склерозированной стенкой, созревающей грануляционной тканью, а также волокнистой соединительной тканью. В составе молодой соединительной ткани характерно наличие значительного количества фибробластов различной степени зрелости, находящихся на близком расстоянии друг от друга (рис. 5), что не типично для зрелой рыхлой соединительной ткани, в которой дифференцированные фибробласты разделены значительным количеством аморфного межклеточного вещества и коллагеновых волокон.

 

Рис. 5. Группа фибробластов из соединительнотканной капсулы, сформированной вокруг имплантата из фторакса, 7-е сутки. ТЭМ. '7000

 

В большинстве своем такие фибробласты имели удлиненную форму клеточного тела, характерную для фиброцитов. Формирующиеся отростки содержали значительное количество белоксинтезирующих структур (грануляционного эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи), однако мембраны ретикулума были несколько расширены и на них еще не было достаточного количества рибосом. Ядра имели мелкозубчатые инвагинации кариолеммы, количество гетерохроматина в них еще весьма незначительно и сконцентрировано тонкой полосой у ядерной мембраны. Довольно часто встречаются на этом сроке гибнущие в результате воспалительного процесса фибробласты. Причем некоторые из них погибали путем некроза. Но встречались и фибробласты, гибнущие путем апоптоза. На ранних стадиях этого процесса изменения касались исключительно ядра. Резко изменялись его форма, ядро сморщивалось, появлялись угловатые резкие инвагинации, плотные темные массы гетерохроматина конденсировались у ядерной мембраны (рис. 6). На более поздней стадии гибели ядро становилось сильно сморщенным электронно-плотным, внутренняя структура в нем практически не различима. Но цитоплазма и содержащиеся в ней органеллы не имели выраженных патологических признаков. Затем происходил очень быстрый распад ядра на ядерные тельца, распадалась цитоплазма и образовавшиеся фрагменты тут же фагоцитировались макрофагами.

 

Рис. 6. Признаки апоптоза у фибробластов соединительнотканной капсулы, образованной вокруг имплантата из фторакса, 7 сутки: А - фибробласт с начальными признаками гибели по типу апоптоза. Ядро характерным образом изменено; В—ядро сильно сморщено, в его структуре преобладает гетерохроматин; С — финальная стадия апоптоза фибробласта. Распад ядра и цитоплазмы на множественные апоптозные тельца. ТЭМ. х10000

 

Клеточная гибель по типу апоптоза в данном случае, очевидно, следует рассматривать как адаптивную реакцию, связанную с молниеносной трансклеточной передачей физиологически активных веществ. В цитоплазме макрофагов в этот период встречались фагоцитированные фрагменты пластмассы, но они были мелкие и их присутствие не приводило к образованию гранулем «инородных тел». По-прежнему отмечалась активация тканевых макрофагов - гистиоцитов.

Коллагеновые волокна в очень большом количестве пронизывали матрикс соединительной ткани. Однако они еще не образуют плотных пучков.

Имплантаты бесцветной пластмассы через неделю были окружены капсулой, состоящей из молодой соединительной ткани, содержащей как клеточные, так и волокнистые элементы, с умеренно выраженной диффузной макрофагальной инфильтрацией.

На седьмые сутки различия между реакцией на виды пластмасс проявляются несколько большим валом грануляционной ткани, окружающей этакрил, и многочисленными включениями фрагментов пластмассы как непосредственно в грануляционную ткань, так и гранулемы «инородных тел». Вокруг проб фторакса лейко-макрофагальная инфильтрация выражена незначительно, гранулемы инородных тел отсутствовали, но в макрофагах имели место небольшие фрагменты пластмассы. Непосредственно к образцам бесцветной пластмассы прилежала созревающая грануляционная ткань с умеренно выраженной инфильтрацией лейкоцитами моно-нуклеарного ряда. Гранулемы «инородных тел» и фрагменты пластмассы в макрофагах не найдены.

Таким образом, к 7 суткам заканчивается (или ослабевает) первая фаза воспаления (за счет скопления сегментоядерных лейкоцитов), достаточно выраженной является 2-я фаза (макрофагальная), но она уже сочетается с признаками 3-й фазы (фибробластической). Активация гистиоцитов, достигающая максимального развития в этот период, свидетельствует о попытках организма бороться с развитием фибросклероза. Гистиоциты пытаются «сдержать» интенсивный синтез коллагена, выделяя фермент коллагеназу, разрушающий коллагеновые волокна.

На 14-е сутки во всех наблюдениях с имплантацией этакрила проба была окружена созревающей грануляционной тканью. Непосредственно к пластмассе прилежала лишь узкая полоска ткани с массивной лимфо-макрофагальной инфильтрацией.

Через 14 суток наблюдались признаки относительной стабилизации процесса, происходит дальнейшее созревание грануляционной ткани у всех животных. Этакриловый имплантат был окружен зрелой соединительной тканью, среди волокон которой располагались гранулемы «инородных тел», содержащие гигантские многоядерные клетки вокруг фрагментов пластмассы, инфильтрация макрофагами была выражена слабо. В этот период еще происходит процесс рассасывания пластмассы, что подтверждается не только наличием гранулем «инородных тел», но и образованием в полированных образцах пластмассы пор, в которые проникали коллагеновые волокна.

Вокруг имплантата из фторакса сформировалась соединительнотканная капсула со слабо выраженной макрофагальной инфильтрацией.

В окружающей жировой клетчатке имел место умеренно выраженный склероз за счет разрастания аргирофильных волокон.

На 14-е сутки пробы бесцветной пластмассы были окружены зрелой волокнистой соединительной тканью, количество сосудов уменьшалось, воспалительная инфильтрация стромы была незначительна и представлена только клетками мононуклеарного ряда.

Период активной пролиферации фибробластов в основном заканчивался, так как молодые малодифференцированные клетки встречались редко. Основным клеточным компонентом уже заметно более плотной соединительнотканной капсулы являются типичные зрелые фибробласты с хорошо сформированными отростками, активно синтезирующие коллаген, который теперь, наряду с диффузным расположением отдельных волокон, имеет вид плотных пучков. В строме соединительной ткани становятся заметны ретикулярные и эластические волокна.

В соединительнотканную капсулу к этому времени прорастают сосуды, осуществляющие питание развивающейся и созревающей соединительной ткани. Стенки большинства сосудов склерозированы в большей или меньшей степени.

Три недели спустя проба пластмасс была окружена зрелой волокнистой соединительной тканью с небольшим количеством сосудов и единичными макрофагами и лимфоцитами.

Морфологически «ложе» вокруг имплантата образовано нормальной соединительной тканью. Признаков воспаления практически нет (т.е. лейкоцитарная фаза закончилась полностью). Следы макрофагальной реакции еще обнаруживаются. В соединительной ткани встречаются крупные многоядерные клетки, однако они уже единичны.

Выраженной фагоцитарной реакции со стороны гистиоцитов и плазматических клеток, имеющихся в очень незначительном количестве, нет. Весьма характерно для этого периода наличие очень крупных плотных пучков коллагеновых волокон. Фибробласты представлены преимущественно зрелыми формами.

Патологические изменения выявляются в них редко, однако в целом для них характерны признаки функционального напряжения. Среди них много гиперхромных клеток с более темной цитоплазмой, чем у контрольных животных. Ядра, занимающие обычно центральное положение, очень часто сдвинуты на периферию клеточного тела, цитоплазма может выглядеть вакуолизированной за счет гипертрофического расширения цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума. Все эти изменения обратимы и с течением времени должны исчезнуть (хотя могут сохраняться месяцами). Фибробласты находились все еще на более близком расстоянии друг к другу, чем обычно. Они разделены аморфным межклеточным матриксом с рыхлыми пучками коллагеновых волокон.

В группе животных, проживших месяц после операции, имплантаты из пластмассы были обнаружены только у 5 крыс из 21 -й. В остальных случаях произошло самопроизвольное отторжение пластмассы. Макро- и микроскопическая картины послеоперационного рубца были аналогичны тем, что наблюдались на 21-е сутки эксперимента, то есть имел место склероз стенок сосудов и стромы окружающей жировой клетчатки. У животных, которым подшивалась проба фторакса, этот процесс был более выраженным. На этом сроке отметить какие-либо другие особенности в группах, где использовались различные виды пластмассы, нам не удалось.

Таким образом, нами проведено морфологическое изучение реакции гиподермы на материалы, используемые в современной стоматологии. В целом его результаты сопоставимы с данными, полученными другими авторами. Исследователи указывают на преимущества искусственных материалов для носителей - отсутствие иммуногенных свойств, сниженный риск переноса инфекции и большая доступность. Вместе с тем, отмечается и их недостаток - отсутствие факторов, способствующих органотипической пролиферации и дифференцировке клеток реципиентного ложа или клеток, нанесенных in vitro на их поверхность. Если считать, что биоматериал не должен вызывать неприемлемых для клинического использования воспалительных и дистрофических изменений в тканях, то наименьшей реактогенностью из металлов обладает золото. Реактогенность пластмасс практически сопоставима друг с другом по выраженности, но в наименьшей степени выражена у фторакса, что соответствует экспериментальным данным других исследователей [13, 14].

Sobre autores

A. Guseva

Kirov Military Medical Academy

Autor responsável pela correspondência
Email: redaktor@celltranspl.ru
Rússia, Saint-Petersburg

L. Ryseva

Kirov Military Medical Academy

Email: redaktor@celltranspl.ru
Rússia, Saint-Petersburg

A. Guk

Kirov Military Medical Academy

Email: redaktor@celltranspl.ru
Rússia, Saint-Petersburg

V. Rumakin

Kirov Military Medical Academy

Email: redaktor@celltranspl.ru
Rússia, Saint-Petersburg

Bibliografia

Arquivos suplementares