Obtaining multipotent cells from GPR125+ spermatogenic stem cells

Full Text

Сперматогенез является тонко регулируемыми сложным процессом, в который вовлечено несколько типов клеток. К ним относятся клетки, способные дифференцироваться в гаметы; гормон-секретирующие клетки Лейдига и клетки Сертоли, обеспечивающие регуляцию и дифференцировку клеток полового ряда. Первичные половые клетки, или гоноциты, имеют внегонадное происхождение. Они обособляются на задней стенке первичной кишки от прочих клеток формирующегося эмбриона и мигрируют в область зачатка половых желез на вентральной стороне мезонефроса. У эмбрионов мужского пола мигрирующие в гонады гоноциты делятся несколько раз. Тем самым они преобразуются в просперматогонии и создают некоторое число [определенный, но не окончательный пул) стволовых сперматогенных клеток. Затем сперматогенез приостанавливается на этом этапе и возобновляется уже при наступлении полового созревания, когда происходит дифференцировка стволовых клеток в сперматогонии типа А [темная цитоплазма). Они медленно делятся с образованием светлых быстроделящихся прогениторных клеток, дающих начало сперматогониям типа В. Последние, в свою очередь, вступают на путь дифференцировки в сперматоциты, а далее в сперматиды и сперматозоиды.

Культивирование сперматогенных стволовых/прогениторных клеток [СпСПК) до последнего времени являлось трудновыполнимой задачей, так как выделенные из протоков извитых семенных канальцев клетки даже на фидерном слое инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов быстро теряют пролиферативную активность [1]. Тем не менее, используя специфический коктейль факторов роста, в состав которого входили glial cell line-derived neurotrophic factor, EGF, bFGF и LIF, T. Shinohara с соавт. [2003) удалось культивировать СпСПК мыши в течение длительного времени [2]. После пятимесячного культивирования трансплантация полученных клеток [germinal stem cells, GS-клетки) бесплодным мышам приводила к восстановлению сперматогенеза. Формирования тератом или каких-либо соматических тканей обнаружено не было, что свидетельствовало о том, что GS-клетки надежно коммитированы в сперматогенном направлении.

Однако в более позднем исследовании T. Shinohara с соавт. [2004) обнаружили, что после 4-7 недель культивирования GS-клеток, наряду с типичными колониями, выявляются колонии клеток, по своей морфологии сходные с ЭСК [3]. Более того, клетки ЭСК-подобных колоний удалось выделить и размножить при культивировании в среде, содержащей 15% сыворотки плодов коров и LIF, что является стандартным условием культивирования ЭСК. ЭСК-подобные клетки дифференцировались в разные типы соматических клеток при индукции in vitro и формировали тератомы при трансплантации иммунодефицитным мышам. Введение ЭСК-подобных клеток в полость бластоцист приводило к образованию химерных эмбрионов. Наличие в семенниках неонатальных мышей клеток с мультипотентной природой позже было подтверждено немецкой исследовательской группой К. Guan и др. [2006). Полученные при культивировании СпСПК мыши мультипотентные клетки получили обозначение maGSCs [multipotent adult germline stem cells) [4]. Тем не менее, фенотипический профиль специфической субпопуляции сперматогенных клеток, которые могут при культивировании конвертироваться в ЭСК-подобные клетки, остается плохо изученным.

Ранее было показано, что поверхностный белок GPR125, экспрессирующийся в семенниках неонатальных мышей, является потенциальным маркером СпСПК [5]. Группа исследователей под руководством S. Rafii из Медицинского института Говарда Хьюза предположила, что GPR125⁺является маркером субпопуляции сперматогенных клеток, конвертирующихся в ЭСК-подобные клетки при длительном культивировании.

На первом этапе исследования, для визуализации экспрессии GPR125 генноинженерными методами были получены мыши, несущие ген LacZ, под контролем GPR125-npoмотора. Окрашивание срезов семенников на наличие галактозидазы показало, что экспрессия маркера обнаруживалась лишь в извитых семенных канальцах и ограничивалась первым слоем клеток, непосредственно прилегающих к базальной мембране, то есть являвшихся сперматогониями.

Культивирование GPR125⁺ клеток на обычном слое фидерных клеток оказалось неэффективно. Тогда авторы использовали фидерный слой из инактивированных тестикулярных стромальных клеток, содержащих CD34⁺ перитубулярные клетки, которые, как ранее было показано, могут играть ключевую роль в экспансии сперматогенных клеток [6]. Культивирование сперматогенных клеток от Gpr125^lacZ/lacZ мышей приводило к получению пролиферирующих колоний с экспоненциальной фазой роста. Клетки многократно пассировались и поддерживались в культуре вплоть до года без каких-либо признаков трансформации. На протяжении всего времени культивирования клетки поддерживали постоянный уровень экспрессии GPR125 и не экспрессировали поверхностный маркер c-kit [рис.].

Схема эксперимента

Молекулярная идентичность GPR125⁺СпСПК после долговременного культивирования подтверждалась количественной ПЦР. СпСПК экспрессировали герминальные транскрипционные факторы Dazl, PLZF, Mvh и не экспрессировали транскрипционные факторы, характерные для более поздних стадий дифференцировки сперматогенных прогениторных клеток [Sox17, Tnp1, Adam2, Prm1 и Pgk2). Эти данные свидетельствуют, что репопулирующие СпСПК имели герминальное происхождение и при этом находились в недифференцированном состоянии. Таким образом, авторы создали условия, которые позволили получить долговременную культуру GPR125⁺ сперматогоний.

На следующем этапе эксперимента изучалась способность GFP⁺ GPR125^lacZ/lacZ СпСПК восстанавливать сперматогенез у обработанных бисульфаном C57BI6 мышей. На 2-3-й месяц посттрансплантационного периода выявлялось большое количество GFP⁺ Gpr125^lacZ/lacZ колоний герминальных клеток внутри извитых семенных канальцев реципиентов. Клетки этих колоний характеризовались типичной сперматогенной морфологией. Окрашивание на наличие галактозидазы подтвердило, что небольшая субпопуляция GPR125⁺ [LacZ⁺) клеток среди общей массы GFP⁺ клеток непосредственно контактировала с базальной мембраной.

Как и в исследовании T. Shinohara et al. [2004], после трех месяцев культивирования СпСПК наряду с типичными колониями наблюдалось появление ЭСК-подобных колоний клеток, обозначенных авторами как MACSs [multipotent adult spermatogonial-derived stem cells). MACSs имели более высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение и успешно пролиферировали в среде для культивирования мышиных ЭСК. Абсолютное большинство MACSs после длительного культивирования имели нормальный кариотип без каких-либо цитогенетических аномалий и экспрессировали высокие уровни GPR125 и Ост4.

Потенции Gpr125^lacZ/lacZ MASCs на первом этапе оценивались путем формирования и дифференцировки эмбриоидных телец in vitro [7]. В течение 7 дней после посева в формирующихся эмбриоидных тельцах выявлялись разные уровни экспрессии GPR125 с четкими границами между GPR125⁺ и GPR125 областями. Полностью сформированные колонии содержали HNF3b⁺ [FGXA2⁺] клетки, являющиеся производными энто- или эктодермы, цитокератин-позитивные или GFAP⁺ клетки, являющиеся производными эктодермы, и клетки, экспрессирующие миозин скелетных мышц и являющиеся производными мезодермы.

Подкожная трансплантация GPR125^lacZ/lacZ MASCs иммунодефицитным мышам приводила к формированию тератом [в 14 из 14 случаев). Гистологический и иммуногистохимичекий анализ тератом показал наличие производных всех трех зародышевых листков. Введение GPR125^lacZ/lacZ MASCs в полость бластоцист приводило к формированию химерных эмбрионов с эффективностью 22% [8 эмбрионов из 37 бластоцист).

Анализ экспрессии транскрипционных факторов GPR125^lacZ/lacZ MASCs в сравнении с ЭСК, СпСПК и мышиными эмбриональными фибробластами показал высокий уровень экспрессии Gct4, Nanog и Sox2 в MASCs и ЭСК. Минимальная экспрессия типичных маркеров сперматогенных стволовых клеток, Plzf, Ret и StraS, наблюдалась у MASCs, тогда как высокая степень экспрессии этих факторов, как и ожидалось, обнаруживалась у СпСПК. Удивительно, что некоторые герминально-ассоциированные факторы транскрипции [например, Dazl) практически не экспрессировались в MASCs, как и некоторые типичные факторы транскрипции ЭСК [Gdf3, Esg1, Rex1). Различия в экспрессии этих генов свидетельствуют, что MASCs являются отдельным типом стволовых клеток.

Таким образом, авторы исследования охарактеризовали GPR125 как поверхностный клеточный маркер, характеризующий популяцию самообновляющихся c-kit PLZF⁺ СпСПК, которые способны восстанавливать сперматогенез при трансплантации мышам и конвертироваться в GPR125⁺ MASCs при длительном культивировании. Полученные данные позволяют утверждать, что ЭРР125⁺сперматогенные клетки являются клетками-предшественниками MASCs.

About the authors

S. A. Sergeyev

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

Yu. B. Dyakova

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Scheme of the experiment

Download (788KB)

Indexing metadata