Therapeutic effects of systemic transplantation of cultured autologous mesenchymal stem cells derived from bone marrow in patients with resistant pulmonary tuberculosis
- Авторлар: Vasiljeva I.A.1, Konoplyannikov A.G.2, Erokhin V.V.1, Tsyb A.F.2, Bagdasaryan T.R.1, Danilenko A.A.2, Lepekhina L.A.2, Kalsina S.S.2, Semenkova I.V.2, Agaeva E.V.2
-
Мекемелер:
- Central Tuberculosis Research Institute, RAMS
- Medical Radiological Research Center, RAMS
- Шығарылым: Том 2, № 1 (2007)
- Беттер: 77-80
- Бөлім: Clinical experience
- ##submission.dateSubmitted##: 03.02.2023
- ##submission.dateAccepted##: 03.02.2023
- ##submission.datePublished##: 15.03.2007
- URL: https://genescells.ru/2313-1829/article/view/183663
- ID: 183663
Дәйексөз келтіру
Толық мәтін
Толық мәтін
Введение
Системное (внутривенное) введение мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в организм в настоящее время рассматривается как один из перспективных методов активизации репаративных процессов в поврежденных органах и тканях [1, 2]. Для легких оседание МСК в тканях документировано в ряде исследований [3, 4], однако проявления биологического эффекта клеточной терапии поврежденных легких с использованием МСК неоднозначны, а возможный терапевтический эффект практически не изучен [5-7]. Необходимость использования дополнительного воздействия на способность поврежденной легочной ткани к репарации в некоторых ситуациях весьма остра. К ним, несомненно, относятся ситуации лечения больных с резистентными формами туберкулеза. Мы уже сообщали о нашем первом опыте такой терапии [8], а в данной работе предпринята попытка обобщить некоторые из полученных результатов работы, которая ведется силами двух наших научных учреждений в течение последних 3 лет.
Материал и методы
Под наблюдением в нашем исследовании, начатом три года назад, находятся 27 больных с туберкулезом легких, из которых 15 пациентов относятся к категории MDR (multidrug resistance), а 12 пациентов - к категории X-DR (X-drug resistance). Лечение подобных больных представляет сложную терапевтическую задачу, обусловленную устойчивостью возбудителя заболевания к большинству противотуберкулезных препаратов, в т. ч. - к наиболее активным. По сути дела, MDR и, особенно, X-DR туберкулез сродни туберкулезу доантибактериальной эпохи, против которого нет эффективных средств этиотропной терапии.
Информация о поле, возрасте пациентов и продолжительности заболевания представлена в табл. 1. Распространенность патологического процесса в легких представлена в табл. 2.
Все пациенты после выявления заболевания подвергались специфическому лечению стандартными режимами химиотерапии, а после выявления лекарственной устойчивости возбудителя использовали схемы на основе резервных химиопрепаратов в соответствии с данными тестов на чувствительность микобактерий туберкулеза (МВТ). Длительная комбинированная противотуберкулезная терапия у данной группы пациентов не оказала желаемого эффекта, больные перешли в категорию хронических с постоянным выделением мультирезистентных форм микобактерий и прогрессирующими воспалительно-деструктивными изменениями в легочной ткани. При этом, у 17 (63,0%) больных наблюдались фиброзные полости распада, которые, как правило, не поддаются терапевтическому лечению даже в случае сохранения чувствительности МВТ к химиопрепаратам.
В этой ситуации возникла необходимость дополнения проводимого лечения процедурой системной трансплантации аутогенных МСК, проводимой в рамках разработанного клинического протокола, утвержденного Учеными Советами двух учреждений и одобренного Этическим Комитетом ЦНИИТ РАМН, а также на основе информированного согласия каждого пациента. Исследование проводилось в рамках отраслевой программы «Новые клеточные технологии - медицине», утвержденной Президиумом РАМН 29 мая 2002 г.
Метод получения и размножения аутогенных МСК в необходимом для системной трансплантации количестве (порядка 150-200 млн клеток) в настоящее время разрешен Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития МЗиСР РФ (лицензия ФС-2006/206). Описание этого метода уже представлено в публикации [3] и коротко сводится к следующему.
Клетки костного мозга (0,5-1 мл) получали путем пункции грудины или подвздошной кости пациента под местной анестезией в строго стерильных условиях, которые соблюдали в процессе всей дальнейшей работы с клетками в культуральном боксе. После отстаивания эритроцитов в течение 1 -2 часов при комнатной температуре супернатант из суспензии костномозговых клеток отсасывали пастеровской пипеткой, выделенные клетки переносили в среду 199 (здесь и далее указанные среды и посуда закупались в фирмах, уполномоченных на поставку МЗиСР РФ). Полученную суспензию клеток центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин для получения осадка, который ресуспендировали в ростовой среде. В качестве ростовой среды использовали среду RPMI-1640, содержащую пенициллин (100 ЕД/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин (2 мМ) и 20% эмбриональной бычьей сыворотки. Культивирование проводили в пластиковых флаконах Карреля c площадью дна 25 см2, в которые вносили 5x106-107 клеток костного мозга в 8 мл ростовой среды. Флаконы продували газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещали в термостат на 37°0. Продувание флаконов такой газовой смесью проводили каждый раз, когда меняли среду или пересевали клетки в новые культуральные флаконы. При достижении сливного (конфлюентного) монослоя клетки пересевали с использованием 0,25% раствора трипсина в новые флаконы, вначале с той же площадью дна (25 см2), а впоследствии - при нарастании клеточной массы - с площадью дна 175 см2. Такой метод культивирования позволял к концу 5-6-й недели добиться получения популяции аутогенных МСК пациента в количестве (1,5-2)x108 клеток, необходимой для трансплантации в организм донора исходного костного мозга. Дополнительно проведенными исследованиями было показано, что полученные в условиях примененного в нашей работе способа культивирования клетки человека во всех исследованных случаях имели фенотип CD10ow/CD34-/CD45-/CD105+/c-kit-, что характерно для клеток, относимых в настоящее время к МСК. Как мы уже сообщали ранее [3], в выполненных на лабораторных животных опытах была показана безопасность применения полученных таким способом культур МСК в отношении мутагенного, тератогенного и канцерогенного эффектов.
Таблица 1. Сведения о распределении пациентов по полу, возрасту и продолжительности выявленного заболевания туберкулезом легких
Число больных | Пол | Возраст | Длительность заболевания после его выявления | |||||||
муж. | жен. | 17-29 лет | 30-39 лет | 40-49 лет | 50-59 лет | 6-12 мес. | 13-24 мес. | 2-3 года | 3-5 лет | |
Абс. 27 | 17 | 10 | 17 | 5 | 4 | 1 | 10 | 4 | 11 | 2 |
% 100 | 63,0 | 37,0 | 63,0 | 18,5 | 14,8 | 3,7 | 37,0 | 14,8 | 40,7 | 7,4 |
Таблица 2. Распространенность туберкулезного процесса в легочной ткани у хронических больных мультирезистентным туберкулезом
Число больных | Распространенность туберкулезного процесса | ||
1-2 сегмента | 1-2 доли | 3 и более долей | |
Абс. 27 | 3 | 11 | 13 |
% 100 | 11,1 | 40,7 | 48,2 |
Перед внутривенным введением пациентам клеток из полученных выращиванием в культуре популяций делался посев для контроля возможного бактериального загрязнения (его не было выявлено ни в одном случае). Для осуществления системной трансплантации 150-200 млн аутогенных МСК, размноженных в культуре, клетки взвешивались в 200 мл стерильного физиологического раствора, содержащего гепарин в концентрации 10 ед/мл, и путем постановки капельницы вводились пациенту в течение 40-60 минут. Примерно у 20% пациентов трансплантация МСК приводила к развитию слабой трансфузионной реакции (повышение в первые сутки температуры до 37,2-37,4°С, ломота, разбитость), которая не требовала дополнительного пособия и исчезала на следующие сутки.
После системной трансплантации аутогенных МСК пациенты продолжали получать ранее назначенное медикаментозное лечение. Контроль за результатами лечения вели по динамике клинических проявлений заболевания, бактериовыделения и специфических изменений в легких по данным рентгенотомографического и КТ исследований.
Результаты и их обсуждение
После системной трансплантации МСК из 27 пациентов 16 наблюдаются в течение 1,5-2 лет и более, а остальные 11 пациентов - не менее 6 месяцев. Спустя от 1 до 5 месяцев после введения МСК у всех 27 больных наблюдался положительный клинический эффект: улучшение общего состояния, уменьшение одышки, значительное уменьшение или исчезновение слабости и недомогания, 24 пациента значительно прибавили в весе и отмечали «прилив сил и энергии».
У всех больных на момент введения МСК отмечались воспалительные изменения в клиническом анализе крови: лейкоцитоз с увеличением палочкоядерной фракции, моноцитоз и /или лимфопения, ускорение СОЭ до 27-65 мм/ч. Через 1 -2 месяца после трансплантации стволовых клеток показатели периферической крови улучшались: нормализовалось количество лейкоцитов, моноцитов и лимфоцитов, СОЭ снижалась до нормальных и субнормальных цифр (2-19 мм/ч).
Одним из наиболее важных критериев активности специфического процесса является бактериовыделение. У 20 (74,1%) больных, длительное время выделявших микобактерии туберкулеза, через 3-4 месяца после трансплантации аутогенных МСК отмечено стойкое прекращение бактериовыделения, подтвержденное микробиологическими и молекулярно-генетическими методами.
Наиболее полную информацию о течении, характере и распространенности туберкулеза дают рентгенотомографические методы исследования. Так, у 11 (40,7%) больных в дальнейшем наступило заживление длительно существующих каверн в легочной ткани, в т. ч. числе фиброзных - в 7 наблюдениях. У 15 пациентов отмечалось выраженное рассасывание воспалительных изменений, частичное закрытие полостей распада и/или уменьшение их размеров при множественных деструкциях. В качестве примера заживления существующих более 2-х лет каверн в обоих легких приводятся рентгенограммы больной Б. до введения МСК и спустя 6 и 17 месяцев после него (рис.).
Рентгенограммы легких у пациентки Б. до проведения системной трансплантации аутогенных МСК (А), а также через 6 (В) и 17 (C) месяцев после трансплантации: А - в верхних долях обоих легких определяются сформированные каверны с неравномерно широкими стенками, перикавитарной инфильтрацией и очагами отсева по всем полям легких; В - слева на месте каверны - фиброзная трансформация легочной ткани, справа каверны значительно уменьшились в размерах, отмечается рассасывание перикавитарной инфильтрации и очагов отсева; С - заживление каверн в обоих легких с развитием рубцовой ткани
В настоящий период у 9 (56,3%) из 16 пациентов, которым трансплантировали МСК 1,5-2 года назад, можно констатировать стойкую ремиссию туберкулезного процесса с рассасыванием воспалительных и исчезновением деструктивных изменений в легких, у 6 (37,5%) - существенную положительную бактериологическую и морфологическую динамику. Лишь в одном случае из 16 эффект трансплантации МСК ограничился непродолжительным клиническим улучшением. Остальные 11 больных продолжают начатое ранее лечение, об эффективности которого можно будет судить спустя 12-15 месяцев.
Заключение
Таким образом, полученный в данном пилотном исследовании материал позволяет надеяться на то, что использование системной трансплантации аутогенных МСК открывает новые перспективы при лечении пациентов с резистентными формами легочного туберкулеза. Природа наблюдаемых эффектов пока остается недостаточно понятной, можно только констатировать усиление регенеративных процессов в поврежденных участках легких. Вызваны ли они длительным существованием в тканях трансплантированных МСК с их необычными иммунологическими свойствами (способностью ослаблять продукцию активных форм кислорода клетками, принимающими участие в развитии воспалительных процессов [9]) или эффекты опосредуются в основном через паракринные механизмы [10], или еще какими-то другими возможными механизмами, например, нормализацией кроветворения с уменьшением доли клеток-продуцентов фактора некроза опухолей, что существенно для развития патологических процессов в поврежденных тканях легкого при туберкулезе, можно будет выяснить только на основе продолжения экспериментально-клинических работ в данном направлении. Одновременно можно отметить, что полученные результаты указывают на перспективность использования аутогенных МСК при лечении резистентных форм легочного туберкулеза не только путем проведения клеточной терапии, но и генной терапии, основанной на использования МСК для доставки ряда генов в поврежденные ткани легкого (например, гена у-интерферона).
