The comparative analysis of the methods for evaluation of proliferative activity of rats' bone marrow mononuclears on the background of allogeneic mononuclear cells transfusion

Abstract

Full Text

Физиологическое состояние и функциональная активность клеток характеризуется показателями кинетики клеточного цикла и пролиферативной активностью (Кольман Я., 2000). О пролиферативной активности предложено судить по величине суммарной доли S и G2/M фаз клеточного цикла методом проточной цитометрии (Camplejohn R.S., 1995; Steck K., 1999), а также путем выявления количества клеток, находящихся в М фазе клеточного цикла. Для этих целей используют антитела к фосфорилированной форме гистона Н3, экспрессия которого наблюдается при митозе (Кудрявцев И.В., 2012). Анализ доступной литературы показал отсутствие работ по исследованиям пролиферации и кинетике клеточного цикла мононуклеарных клеток (МНК), оценке соотношения фаз клеточного цикла в различные сроки после трансплантации мононуклеарной фракции КМ реципиента, без предварительного подавления иммунитета. В связи с этим, целью данной работы явилась оценка количества МНК КМ, находящихся в различных фазах клеточного цикла до и после трансплантации аллогенных МНК КМ, без подавления иммунитета реципиента. Материал и методы. Исследование проведено на беспородных белых крысах 4-месячного возраста. В первую группу вошли контрольные животные (I), во вторую - животные, которым выполнялось введение МНК КМ - 3 мес. (II), в третью - 6 мес. после введения (III) и в четвертую 9 мес. после введения (IV). Во всех сериях животные были без иммунной компрометации. МНК КМ получали путем промывания раствором Хенкса (ПанЭко, Россия) бедренных костей. Полученную суспензию наслаивали на градиент фиколла 1,077 (Sigma, США), центрифугировали, собирали интерфазу, проводили подсчет МНК КМ. Для эксперимента использовали суспензии, в которых жизнеспособных МНК КМ было не менее 95%. Суспензию МНК КМ вводили в хвостовую вену, из расчёта 3,0х106 клеток на 1 кг массы тела. Анализ фаз клеточного цикла проводили на цитофлуориме-тре FACS Calibur (Beckton Dickinson, США) с использованием ПО CellQuestPro. ДНК окрашивали йодистым пропидием (ИП) (Beckton Dickinson, США) и антителами к гистону Н3 (Beckton Dickinson, США), в качестве диплоидного контроля использовали лимфоциты периферической крови донора. Пролиферативный индекс рассчитывали по формуле: ПИ = S + G2/M. Полученные данные обработаны статистически с использованием непараметрического критерия Фишера - Стьюдента, изменения считали достоверными при р<0,05. Результаты. Анализ данных по распределению МНК КМ по фазам клеточного цикла позволил установить, что при окрашивании ДНК ИП у крыс контрольной группы (I) 67,0±3,0% находилось на стадии G0/G1 10,0±1,0% - в фазе S, 16,0±1,0 - на стадии G2/M, пролиферативный индекс составил 27,4±4,5. Во II группе не выявлено статистически достоверных изменений, 73,0±2,0% МНК КМ находились на стадии G0/G1 9,0±0,8% - в фазе S, 17,0±2,0% - на стадии Gg/M, пролиферативный индекс составил 26,57±2,76. В III группе не было выявлено статистически достоверных изменений 72,2±2,0% МНК КМ находились на стадии G0/G1, 9,0±0,8% в фазе S, 17,0±2,0% на стадии G2/M, пролиферативный индекс составил 27,2±2,7. В IV группе выявлено статистически достоверное (р<0,001) увеличение МНК КМ, 81,09±0,9% в фазе G0/G1, на стадии S и G2/M статистически достоверное снижение - 4,0±0,3% и 12,0±1,0% соответственно. Пролиферативный индекс статистически достоверно был снижен - 17,02±1,14. По данным окрашивания антителами к Н3, выявлено достоверное (р<0,001) увеличение процента Н3-гистонпозитивных МНК КМ у реципиентов в динамике, по сравнению с контролем. Так, у крыс группы I показатель составил 1,06±0,15%, во II группе - 0,42±0,11%, в III группе - 0,47±0,16%, в IV группе - 0,55±0,11%. Заключение. Результаты исследования позволили установить, что внутривенное введение аллогенных МНК КМ не демонстрирует статистически достоверных изменений в пролиферации МНК КМ реципиента к третьему и шестому месяцу после трансфузии по данным ДНК-цитометрии. К девятому месяцу после трансфузии имеется тенденция МНК КМ к переходу в фазу покоя (G0/G1), а также, вероятнее всего, эффект от введения МНК КМ у экспериментальных животных, согласно нашим данным, проявляется и сохраняется не более трех календарных месяцев. Считаем, что наряду с традиционными методами оценки распределения по фазам цикла в ДНК-цитометрии необходимо использовать дополнительные методические подходы в оценке пролиферативной активности популяции, в том числе для характеристики количества клеток в состоянии митоза проводить окрашивание фосфо-рилированной формы гистона Н3. В данном случае сочетанные подходы в выявлении пролиферирующих клеток позволили точно установить как суммарное значение пролиферативного индекса, так и уровень МНК, находящихся на стадии митоза. Данное исследование проведено в рамках бюджетного финансирования Республики Казахстан.