Influence of storage conditions on the viability of spheroids from human chondrocytes

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в России практически отсутствуют технологии, направленные на восстановление гиалинового хряща, повреждения которого нарушают функцию сустава, вызывают боль и снижение его подвижности. Помимо использования симптоматических противовоспалительных лекарственных средств, основными терапевтическими агентами в настоящее время являются препараты на основе гиалуроновой кислоты и аутологичной тромбоцитарной массы, которые дают лишь кратковременный эффект в виде облегчения симптоматики и небольшую отсрочку операции по протезированию сустава. В свою очередь эндопротезирование суставов сопряжено с большими рисками и часто сопровождается многочисленными побочными эффектами в виде инфекций, тромбозов, нарушения подвижности сустава и изменения длины конечности [1–3].

В связи с этим в Федеральном научно-клиническом центре физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства разработана технология получения хондросфер, посредством применения которых возможно прервать цепь развития патологии: травматическое повреждение суставного хряща — воспаление — дегенерация хрящевой ткани. Получение 3D-хрящеподобных конструктов на основе аутологичных хондроцитов является перспективным направлением для коррекции объёмных дефектов суставного хряща. Предлагаемая к использованию в клинике органоидная технология 3D-культивирования [4] позволяет сохранить зрелое дифференцированное состояние клеток, способных к выработке внеклеточного матрикса, что приближает хондросферы по характеристикам к нативной ткани.

За рубежом подобные технологии уже успешно внедрены в клиническую практику. Аналог предлагаемого к исследованию препарата применяется компанией CoDon (Германия) [5]. Кроме того, в РФ компания «Генериум» производит биомедицинский клеточный продукт Spherox по лицензии упомянутой выше компании.

Нами ранее разработана технология получения трёхмерных структур, которая была значительно оптимизирована для производства хрящевых имплантатов [6]. Для дальнейшего применения данной разработки в клинических исследованиях необходимо определить условия хранения и транспортировки, при которых бы сохранялись важнейшие показатели качества, например жизнеспособность клеток. Однако данные по стабильности сложнокомпонентных биологических препаратов, в том числе 3D-сфероидов на основе хондроцитов, часто являются коммерческой тайной компаний-производителей и поэтому практически не публикуются в открытых источниках.

Клеточные препараты — дорогие в производстве и сложные биологические объекты, которые обладают множеством различных свойств. Поэтому необходимо всесторонне оценить влияние на клетки внешних факторов, таких как условия хранения, состав среды, температура и сроки хранения. К ключевым характеристикам клеточных сфероидов можно отнести жизнеспособность, которая определяется входящими в их состав клетками. В настоящее время не существует отработанных протоколов длительного хранения путём заморозки подобных 3D-структур, которые помимо клеток содержат в своём составе компоненты внеклеточного матрикса, разрушающиеся при традиционных условиях криоконсервации [7]. Снижение жизнеспособности клеток, входящих в состав хондросфер, под воздействием неблагоприятных факторов окружающей среды несомненно окажет влияние на результаты дальнейших исследований. Таким образом, необходимо определить условия хранения и транспортировки 3D-конструкций из хондроцитов до начала клинических исследований, снизив вероятность получения недостоверных результатов.

Выбор подхода к оценке жизнеспособности клеток, входящих в состав хондросфер, представляющих собой 3D-структуры, зависит от целей исследования и используемой в производстве клеточной линии. Кроме того, необходим метод, который не потребует больших временн΄ых и финансовых ресурсов и позволит использовать минимальное количество образцов препарата. Метаболические красители, такие как ХТТ, МТТ, PrestoBlue и другие, представляются наиболее удобными и дешёвыми для использования в качестве реагентов в методиках по анализу жизнеспособности клеток в составе сложнокомпонентных клеточных препаратов [8].

Цель исследования — оценка жизнеспособности и стабильности прототипа препарата тканевой инженерии в виде хондросфер, созданных на основе культур хондроцитов человека, под влиянием различных условий хранения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использованные линии клеток

В работе использовали полученные ранее первичные культуры хондроцитов человека, выделенные из биопсийного материала хряща коленного сустава пациентов с диагнозом, соответствующим кодам М15–М19 по международной классификации болезней 10-го пересмотра.

Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. Ю.М. Лопухина ФМБА России (протокол № 2019/02 от 9 апреля 2019 г.).

Замороженные клетки первичных культур хондроцитов хранятся в криобанке ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. Ю.М. Лопухина ФМБА России. Для размораживания клеток криовиалу нагревали на водяной бане при 37 °С до полного исчезновения льда, после чего клетки отмывали от DMSO в 10 мл предварительно нагретой до 37 °С среды DMEM/F12 («ПанЭко», Россия) путём центрифугирования в пробирке 15 мл (Servicebio, Китай) при 200 g в течение 5 мин. Клеточный осадок ресуспендировали для последующего культивирования в среде DMEM/F12 с добавлением 15% FBS (Servicebio) и высевали на пластиковые чашки Петри с адгезивной поверхностью (Servicebio). Смену среды проводили раз в четверо суток. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) линии iPSRG4S использовали в качестве контроля. ИПСК культивировали в среде ГибриС-8 («ПанЭко») в чашках Петри диаметром 35 мм (Servicebio), предварительно покрытых Матригелем (Corning, США).

Получение 3D-сфероидов в мини-биореакторах

Получение трёхмерных структур из первичных культур хондроцитов и линии ИПСК проводили с помощью оптимизированного протокола, описанного ранее [9]. Для культивирования 3D-культур использовали базовую среду Advanced DMEM/F12 с добавлением 10 нг/мл bFGF (ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. Ю.М. Лопухина ФМБА, Россия), 100х GlutaMAX (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США), 50x B27 (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1% инсулин-трансферрин-селенита («ПанЭко»), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich, США), 50 мкМ β-меркаптоэтанола, 40 мкг/мл гентамицина («ПанЭко»). К среде добавляли 10% собственной сыворотки пациента (англ. serum of patient, SP). Культивирование сфероидов проводили в течение 35 сут. Смену среды осуществляли раз в четверо суток. Каждые 7 сут оценивали морфологию сфероидов с помощью микроскопа с фазовым контрастом Olympus IX53F (Olympus, Япония) и программного обеспечения для морфометрии CellSens Standart.

Получены хондросферы от четырёх пациентов и эмбриональные тельца из ИПСК линии iPSRG4S в качестве контроля. С ними проведены эксперименты по влиянию на жизнеспособность клеток различных условий хранения и транспортировки: +4–8 °С (условия холодильника); 22–24 °С (комнатная температура) и 37 °С (СО₂-инкубатор без подачи углекислого газа) в течение четырёх суток в различных жидкостях: питательная среда DMEM/F12, 0,9% раствор хлорида натрия (физиологический раствор) и фосфатно-солевой буфер (PBS).

Жизнеспособность хондроцитов оценивали с помощью метаболического красителя РrestoBlue (Thermo Fisher Scientific) согласно протоколу производителя. Для этого хондросферы поштучно размещали в лунки, в которые предварительно добавляли 100 мкл физиологического раствора, PBS или DMEM/F12. Далее образцы культивировали в течение 1–3 сут. В качестве отрицательного контроля использовали лунки с клетками и хондросферы, обработанные тритоном Х-100. Затем добавляли 10 мкл реактива PrestoBlue и инкубировали в СО₂-инкубаторе при 37 °С и 5% СО₂ в течение 2 ч. По окончании инкубации определяли оптическую плотность при длине волны возбуждения 560 нм, эмиссию — при 590 нм на приборе Infinite M200 Pro (TECAN, Швейцария). Полученные значения после нормирования (вычитания) показаний отрицательного контроля сопоставляли с калибровочным графиком [10], что позволяло определить остаточное количество жизнеспособных клеток в хондросфере.

Анализ экспрессии ключевых маркёров хондроцитов методом количественной ОТ-ПЦР

Тотальную РНК выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Германия) согласно инструкции производителя. Концентрацию РНК измеряли на спектрофотометре Infinite 200 PRO (TECAN) с помощью микролуночного планшета. Синтезировали кДНК на матрице РНК, используя набор реагентов M-MLV RT kit («Евроген», Россия) согласно инструкции. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с готовым набором для количественной ПЦР qPCRmix-HS SYBR («Евроген»). Для проведения ПЦР используются праймеры, перечисленные в табл. 1. Концентрация каждого из праймеров составляла 10 мкМ, объём реакции — 20 мкл. Амплификацию проводили по следующему протоколу: 1) 95 ^оС — 5 мин; 2) 95 ^оС — 15 с; 3) 58 ^оС — 15 с; 4) 72 ^оС — 30 с. Этапы 2, 3 и 4 повторялись 40 раз. Количественную ПЦР выполняли в амплификаторе Real-Time CFX96 (Bio-Rad, США). Результаты анализировали в программе Microsoft Excel по методу ΔΔCt.

 

Таблица 1. Последовательности праймеров

Table 1. Primer sequences

Название гена	Последовательность 5’-3’	Длина фрагмента, нуклеотиды
ACAN	AGGAGTCCCTGACCTGGTTT	167
ACAN	CCTGACAGATCTGCCTCTCC
COL1A	AGGGTGAGACAGGCGAACA	184
COL1A	CCGTTGAGTCCATCTTTGC
COL2A1	TGGACGCCATGAAGGTTTTCT	142
COL2A1	CCATTGATGGTTTCTCCAAACC
YWHAZ	ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA	94
YWHAZ	CCGCCAGGACAAACCAGTAT

 

Статистическая обработка данных

Результаты измерений обрабатывали с помощью пакетов прикладных программ Microsoft Excel (Microsoft, США) и SPSS Statistics 17.0 (IBM, США). Для проверки нормальности распределения признака применяли тест Шапиро–Уилка. Распределение не подчинялось нормальному закону. В качестве метода сравнения использован непараметрический U-тест Манна–Уитни (Mann–Whitney U-test) с поправкой Бонферрони. Различия между группами считали статистически значимыми при р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Оценка экспрессии хондроцитарных маркёров

Оценка экспрессии генов методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в 2D-культурах, которые используются для получения 3D-структур, показала в клетках от различных пациентов схожий уровень экспрессии генов, кодирующих аггрекан, коллаген I и II типов и транскрипционный фактор SOX9 (рис. 1).

 

Рис. 1. Относительная экспрессия генов хондроцитарных маркёров в линиях хондроцитов человека, полученных от разных пациентов (П). iPSRG4S — культура индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (негативный контроль). Экспрессия генов клетками iPSRG4S показана на графике цифрами справа

Fig. 1. Relative expression of chondrocyte markers in human chondrocyte lines obtained from different patients (П). iPSRG4S — induced pluripotent stem cells culture (negative control). Gene expression by iPSRG4S cells is shown by numbers in the graph on the right

 

Сравнительный анализ уровня экспрессии хондроцитарных маркёров в хондросферах, полученных из хондроцитов различных пациентов, показал отсутствие статистически значимых различий между культурами (р >0,05) на 35-й день культивирования (рис. 2).

 

Рис. 2. Относительная нормализованная экспрессия генов хондрогенных маркёров в трёхмерных культурах хондроцитов (хондросферах), полученных из хондроцитов пациентов (П). 3D iPSRG4S — эмбриональные тельца, полученные из культуры индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (негативный контроль). Экспрессия генов клетками iPSRG4S показана на графике цифрами справа

Fig. 2. Relative normalized gene expression of chondrogenic markers in three-dimensional chondrocyte cultures (chondrospheres) derived from patient chondrocytes (П). 3D iPSRG4S — embryoid bodies obtained from induced pluripotent stem cells culture (negative control). Gene expression by iPSRG4S cells is shown by numbers in the graph on the right

 

Поскольку одной из ключевых характеристик клеток является жизнеспособность, этот показатель был исследован с целью определения оптимальной температуры и сроков хранения хондросфер. Для этого образцы хондросфер помещали в различные изотонические растворы, которые планировались к использованию в качестве транспортных сред. В качестве растворов для хранения и транспортировки использовали PBS, 0,9% раствор хлорида натрия (физиологический раствор) и питательную среду DMEM/F12 без специальных добавок и сыворотки. Далее хондросферы инкубировали в условиях термостата при 37 °С, холодильника (4 °С) или при комнатной температуре (22 °С) в течение 1–4 сут.

Результаты оценки стабильности препарата по показателю жизнеспособности клеток, определённой с использованием реагента PrestoBlue, представлены на рис. 3. Данные на графиках показывают, что статистически значимо выше жизнеспособность клеток при использовании PBS и физиологического раствора по сравнению с применением в качестве среды хранения питательной среды DMEM/F12. Причём данный эффект наблюдается как при +4 °С, так и при +22 °С.

 

Рис. 3. Жизнеспособность образцов 3D хрящевого имплантата в динамике по времени в зависимости от температуры хранения и сред, % жизнеспособных клеток: а — при температуре +4 °С; b — при температуре +22 °С; с — при температуре +37 °С; d1 — первые сутки, d2 — вторые сутки, d3 — третьи сутки, d4 — четвёртые сутки; medium — питательная среда DMEM/F12, PBS — фосфатно-солевой буфер, 0,9% NaCl — физиологический раствор; * статистически значимые различия по сравнению с использованием среды medium, р <0,05

Fig. 3. Viability of 3D cartilage implant samples over time depending on storage temperature and media: а — at a temperature of +4 °C; b — at a temperature of +22 °C; с — at a temperature of +37 °C; d1 — first day, d2 — second day, d3 — third day, d4 — fourth day; medium — nutrient medium DMEM/F12, PBS — phosphate-buffered saline, 0.9% NaCl — physiological solution; * statistically significant differences compared to using the medium (medium), p <0.05

 

Обнаружено, что образцы хондросфер лучше всего сохраняют жизнеспособность при +4 °С в физиологическом растворе. В указанных условиях препарат возможно хранить до четырёх суток. Однако при несоблюдении данного температурного режима наблюдается тенденция к снижению жизнеспособности через двое суток хранения (рис. 3, с). Данного периода времени вполне достаточно для транспортировки препарата до исследовательских центров, а также для проведения ряда контрольных исследований в рамках контроля качества.

Хранение образцов хондросфер при выбранном режиме (+4 °С в течение четырёх суток в физиологическом растворе) с последующим анализом с помощью ПЦР в режиме реального времени выявило сохранение экспрессии хондрогенных маркёров (рис. 4). Выявленное снижение экспрессии генов, кодирующих аггрекан, коллаген I и II типов и SOX9, было статистически незначимо (р >0,05).

 

Рис. 4. Относительная нормализованная экспрессия хондрогенных маркёров в трёхмерных культурах хондроцитов (хондросферах), полученных из хондроцитов пациентов (П), после хранения в течение 4 сут в физиологическом растворе при температуре +4 °С

Fig. 4. Relative normalized expression of chondrogenic markers in three-dimensional cultures of chondrocytes (chondrospheres) obtained from patient chondrocytes (П) after storage for 4 days in saline conditions at a temperature of +4 °C

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее показано [11], что культуры хондроцитов, полученные от доноров с различной степенью поражения суставного хряща, обладают разным хондрогенным потенциалом. В нашем случае клетки были получены от пациентов со схожей симптоматикой и сопоставимой тяжестью заболевания. Оценка экспрессии хондрогенных маркёров клетками показала, что культуры хондроцитов пациентов, формирующие сфероиды, обладают схожими характеристиками.

В работе [12] установлено, что суставные хондроциты, полученные от пациентов с остеоартрозом, демонстрируют «фенотипическую пластичность», сравнимую с мезенхимальными стволовыми клетками при дифференцировке в хондрогенном направлении. В исследовании [13] выявлено, что при развитии остеоартроза в хряще наблюдается увеличение количества клеток, экспрессирующих маркёры мезенхимальных клеток-предшественниц. Кроме того, при остеоартрозе наблюдается увеличение экспрессии генов, кодирующих такие компоненты внеклеточного матрикса, как коллаген I типа, что характерно в норме для волокнистого хряща [13]. В связи с этим клетки, полученные от пациентов для дальнейшего производства тканеинженерного препарата, должны подвергаться анализу синтетической активности и экспрессии основных хондроцитарных маркёров с целью подтверждения их фенотипа. Данные, полученные после проведения ПЦР, позволяют заключить, что такие характерные для хондроцитов маркёры, как аггрекан, коллаген I и II типов, а также SOX9, стабильно экспрессируются культурами клеток. Кроме того, после перевода клеток в 3D-структуру экспрессия изучаемых маркёров сохраняется, что дополнительно подтверждает стабильность ключевых фенотипических показателей хондроцитов, из которых состоят 3D-конструкции.

Оценка жизнеспособности с помощью метаболического красителя PrestoBlue показала, что образцы хондросфер лучше всего сохраняют жизнеспособность при +4 °С до четырёх суток. Выявлено, что культуральная среда хуже подходит для хранения и транспортировки 3D-конструкций из хондроцитов. Следовательно, сфероиды следует транспортировать к месту применения в PBS или физиологическом растворе в течение ограниченного, но достаточного для доставки в исследовательский или клинический центр периода времени — 2 сут (48 ч). Вероятно, следует ограничиться двумя сутками хранения клеточного препарата, поскольку во время транспортировки может наблюдаться длительное воздействие температуры на клетки, например при аварийных ситуациях. Согласно литературным данным, фактический срок годности многих лекарственных препаратов может быть продлён, однако этот показатель зависит от партии производства [14]. Кроме того, к настоящему моменту для препаратов на основе клеток проведено недостаточно исследований стабильности. Приведённые нами результаты будут использованы в дальнейших исследованиях данной клеточной технологии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Оценка жизнеспособности сложнокомпонентных (в том числе тканеинженерных) клеточных препаратов при проведении анализа стабильности в различных условиях хранения может быть использована в будущих исследованиях подобных разработок. Подтверждение экспрессии хондрогенных маркёров является неотъемлемой частью контроля качества подобных тканеинженерных конструкций. Это важно, например, в доклинических/клинических исследованиях, когда запланирована длительная транспортировка хондросфер в другой город. В нашем случае приведённые данные позволяют говорить о стабильной жизнеспособности и функциональной активности, достаточной для транспортировки препарата тканевой инженерии на основе хондроцитов человека в течение не менее 2 сут.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Благодарности. Авторы выражают свою признательность заведующей лабораторией клеточной биологии А.Н. Богомазовой (ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. Ю.М. Лопухина ФМБА России) за критические замечания в отношении финальной версии рукописи.

Источник финансирования. Данная публикация выполнена в рамках государственного задания «Опора-2», номер государственного учёта НИОКТР 121101500075-7.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: П.А. Голубинская — обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, редактирование статьи; А.С. Пикина — выполнение культуральных работ; Е.С. Ручко — проведение лабораторных работ; А.В. Еремеев — финальное редактирование текста статьи, выполнение культуральных работ.

ADDITIONAL INFORMATION

Acknowledgments. We thank to the head of the laboratory of cell biology A.N. Bogomazova (Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency) for critical comments on the final version of the manuscript.

Funding source. This publication was carried out within the framework of the state task “OPORA-2”, the state registration number of R&D 121101500075-7.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors have made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication). The greatest contribution is distributed as follows: P.A. Golubinskaya — literature review, collection and analysis of literary sources, editing of the article; A.S. Pikina — performing cultural work; E.S. Ruchko — carrying out laboratory work; A.V. Eremeev — final editing, performing cultural work.

About the authors

Polina A. Golubinskaya

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Author for correspondence.
Email: polinapigeon@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1765-9042
SPIN-code: 5299-9693

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow

Arina S. Pikina

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Email: arina.pikina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8967-2318
SPIN-code: 8654-7318
Russian Federation, Moscow

Evgenii S. Ruchko

Koltzov Institute of Developmental Biology of Russian Academy of Sciences

Email: ruchkoevgeny@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1361-666X
SPIN-code: 7220-6031
Russian Federation, Moscow

Artem V. Eremeev

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Email: art-eremeev@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3428-7586
SPIN-code: 4825-5440

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files