Application of hydrogel scaffolds as a cell substrate for cartilage tissue regeneration

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Остеоартроз является распространённым дегенеративным заболеванием гиалинового суставного хряща, возникающим вследствие механических травм, ожирения или старения. При остеоартрозе внутри сустава происходит деградация внеклеточного матрикса (ВКМ), хрящ истончается, его поверхность подвергается эрозии, развивается синовиальное воспаление. На клиническом уровне эти процессы проявляются в болевом синдроме и радикальном снижении подвижности сустава. Для лечения тяжёлых повреждений хряща, например при остеоартрите коленного сустава, во всём мире используют хирургические методы: артроскопические операции, остеотомию коленного сустава и тотальное эндопротезирование. Однако искусственные суставы имеют ограниченный срок службы и часто требуют дополнительного хирургического вмешательства при ревизии эндопротеза [1]. По этой причине к настоящему времени предложено несколько стратегий активации репараторных процессов для восстановления суставного хряща на этапе его очаговых дефектов, которые выявляются во время артроскопии почти в 20% случаев [2].

МЕТОДЫ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ СУСТАВНОГО ХРЯЩА

Как известно, хрящевая ткань обладает минимальной эндогенной способностью к восстановлению, поскольку гиалиновый хрящ суставов получает питательные вещества диффузно из синовиальной жидкости [3]. Из-за недостатка кровоснабжения повреждения гиалинового суставного хряща при отсутствии надлежащего лечения могут вести к ранней дегенерации сустава [4]. Одним из успешных подходов к активации регенерации сустава является метод микропереломов, или микрофрактурирования, предложенный в 1985 году R. Steadman. В этом подходе после удаления повреждённых участков сустава и кальцинатов хирург производит множественные проколы суставной поверхности, что позволяет содержимому костного мозга выступить на поверхность. Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) костного мозга, попавшие через проколы на суставную поверхность, помогают заместить её дефект за счёт своей способности дифференцироваться в хондрогенном направлении.

В течение последних десятилетий в клиническую практику было внедрено несколько методов восстановления хрящевой ткани, основанных на принципах регенеративной медицины с использованием многокомпонентных биомедицинских продуктов. К ним прежде всего относятся бесклеточные продукты, приготовленные из плазмы крови, а также содержащие полисахариды; ВКM, синтетические полимеры. В регенеративной терапии остеоартроза также используют биомедицинские клеточные продукты, содержащие хондроциты или МСК, которые могут вноситься внутрь сустава в виде клеточной суспензии или на носителе (рис. 1).

 

Рис. 1. Типы продуктов для терапии поражений хрящевой ткани. МСК — мезенхимальные стромальные клетки, ИПСК — индуцированные плюрипотентные клетки.

Fig. 1. Types of products for the treatment of cartilage defects. МСК — mesenchymal stromal cells, ИПСК — induced pluripotent cells.

 

В качестве терапии остеоартроза и улучшения снабжения хряща питательными веществами было предложено вводить в коленный сустав аутологичную богатую тромбоцитами плазму (англ. platelet rich plasma, PRP). Такая терапия безопасна и может уменьшить боль и улучшить функцию сустава [5]. Однако эффективность использования PRP для лечения дефекта хряща остаётся спорной [6, 7]. Различия в концентрации тромбоцитов, обеспечиваемые разными протоколами подготовки, могут иметь большое влияние на клинические результаты. Кроме того, содержание факторов роста в тромбоцитах отличается у разных людей, что может оказывать эффект на процесс заживления [8].

Одним из первых методов клеточной регенеративной медицины является трансплантация аутологичных хондроцитов (ACI, англ. autologous chondrocyte implantation), впервые описанная в 1994 году. С тех пор метод ACI постоянно совершенствовался и в настоящее время используется в качестве стандартной процедуры для лечения больших дефектов (>3 см²) коленного сустава [9]. Помимо хондроцитов в терапии коленного сустава в последнее время всё чаще используются МСК из разных тканевых источников. МСК можно дифференцировать в различные типы клеток, в том числе в хондроциты. Эти клетки также демонстрируют превосходную способность регенерировать повреждённый хрящ и обеспечивать клинически значимое уменьшение симптомов заболевания опорно-двигательного аппарата как за счёт заполнения тканевого дефекта, так и за счёт секреции коктейля из биологически активных веществ (БАВ) и факторов роста, обладающих противовоспалительным действием. Согласно данным метаанализа [1], терапия с применением МСК эффективна в уменьшении боли и улучшении клинических симптомов остеоартроза.

Дальнейшим развитием технологии ACI стало применение в трансплантации хондроцитов на подложке, в качестве которой вначале использовали лоскут надкостницы, а затем — искусственные коллагеновые мембраны и 3D-матрицы. Данная технология получила название MACI (англ. membrane autologous chondrocyte implantation) [10]. Для большинства клеток, культивируемых в прикреплённом состоянии, например МСК, показано, что выживаемость клеток на подложке гораздо выше при имплантации, чем при инъекции в виде суспензионного раствора [11]. Трёхмерные каркасы, используемые при MACI, могут быть адаптированы к размеру и форме дефекта и способны уменьшить потери культивируемых на них клеток после имплантации. Наиболее часто в MACI применяют мембрану из коллагенов I/III типов с культивируемыми на ней аутологичными хондроцитами [12], хотя в ряде работ показано, что добавление коллагена II типа в мембрану улучшает поддержку фенотипа хондроцитов, усиливает пролиферацию и синтез ВКМ [13]. Мембрана имеет шероховатую сторону, на которой располагаются хондроциты, и гладкую, более плотную сторону, которая обращена в суставную полость, что препятствует миграции клеток в эту полость [14, 15]. Шероховатая сторона имеет больший размер пор по сравнению с гладкой, характеризуется более рыхлым расположением коллагеновых волокон, что облегчает прикрепление хондроцитов и последующий синтез ВКМ [16].

Технология MACI имеет ряд ограничений. Например, головка бедренной кости исключает применение жёстких каркасов, тогда как голеностопный сустав, как правило, нуждается в гораздо более инвазивных подходах, например остеотомии [17]. Кроме того, большинство матриц, используемых в MACI, должны быть зафиксированы в области трансплантации с помощью ксеногенного фиксирующего материала, который может вызывать иммунный ответ и снижать скорость приживления.

В 2002 году была представлена инновационная трёхмерная система культивирования аутологичных хондроцитов без каркаса, которая полностью исключает использование ксеногенного материала при трансплантации. В процессе трёхмерного культивирования создаются сфероиды неохряща, состоящие из редифференцированных аутологичных хондроцитов и специфического для хряща матрикса. Технология трансплантации аутологичных хондроцитов в сфероидах получила название ACT3D (англ. 3-dimensional, scaffold-free, and completely autologous form of chondrocyte transplantation). Как и другие методы ACI, ACT3D требует двухэтапной хирургической процедуры. На первом этапе из поражённого сустава берут образец хрящевой ткани с целью получения необходимого количества клеток для культивирования in vitro. Во время второй операции хондроциты в виде сфероидов имплантируют в место дефекта. Сферическая структура продукта подразумевает определённые преимущества по сравнению с ACI или MACI. Поскольку хондроциты в 3D-структурах дифференцируются и начинают продуцировать ВКМ, они уже находятся в более активном «правильном» состоянии по сравнению с клетками в виде суспензии при ACI, поэтому хондросфера может быстрее заполнить дефект гиалиновым хрящом. Сфероиды легко помещаются в повреждённый участок при артроскопии, прикрепляются к субхондральной кости и нативной хрящевой ткани без дополнительного фиксирующего материала. Метод ACT3D показал многообещающие результаты in vivo на нескольких животных моделях и используется в клинической практике с 2004 года [18, 19].

Следует отметить, что указанные выше виды клеточных продуктов успешно коммерциализируются (табл. 1). В литературе описаны готовые продукты для терапии повреждений хряща, среди которых наиболее часто упоминаются Hyalograft® C (Anika Therapeutics Inc, США; Fidia Farmaceutici S.p.A., Италия) и мембрана MACI® Chondro-gide® (Genzyme Biosurgery, Дания) [12]. Кроме указанных продуктов применяют BioSeed-C® (BioTissue Technologies, Германия), систему регенерации хряща CaReS® (Arthro Kinetics Biotechnology, Австрия), ателоколлаген (RMS Innovations UK, Великобритания), NOVOCART® 3D (Aesculap Implant Systems LLC, США), костно-хрящевой биомиметический каркас NeoCartтм (Histogenics, США), Chondron^тм (Sewon Cellontech, Корея), DeNovo NT Graft (Zimmer Biomet, США), Cartipatch® (Tissue Bank of France, Франция) и Condrograft (BR Medical, Мексика), Chondrosphere® (Spherox) (CO.DON AG, Германия) [12, 20]. Следует отметить, что Hyalograft® C был недавно удалён с европейского рынка Европейской медицинской ассоциацией в результате проблем с производственными процессами и дизайном клинических исследований.

 

Таблица 1. Примеры коммерческих клеточных продуктов для терапии поражений хрящевой ткани

Table 1. Examples of commercial cell products for the treatment of cartilage defects

Тип продукта	Примеры продуктов
ACI	Продукты на основе аутологичных хондроцитов без подложки: Carticel (Genzyme Inc, США); ChondroCelect (TiGenix N.V., Бельгия)
ACT3D	Хондросфера Chondrosphere® (Co.Don AG, Германия)
MACI	Продукты на основе аутологичных хондроцитов, включают жёсткую подложку для клеток: Мембрана MACI® Chondro-gide® (Genzyme Biosurgery, Дания); Chondron™ (Sewon Cellontech, Корея); DeNovo NT Graft (Zimmer Biomet, США); Cartipatch® (Tissue Bank of France, Франция); Hyalograft® C (Fidia Farmaceutici S.p.A., Италия; Anika Therapeutics Inc, США); BioSeed-C® (BioTissue Technologies, Германия); Ortho-ACI (Orthocell, Австралия)

 

Начиная с первого десятилетия XXI века изучается возможность использования в качестве клеточной подложки гидрогелей, которые представляют собой сеть сшитых поперечными связями гидрофильных полимерных цепей в водной дисперсионной среде. Гидрогели могут представлять собой пластичную, биосовместимую, биорезорбируемую подложку для клеток, имитирующую ВКМ. Можно также применять различные комбинации состава гидрогеля для достижения определённых механических свойств, в том числе моделировать градиентную структуру подложки, добавлять лекарственные средства и БАВ. Особенную привлекательность гидрогелям придаёт возможность их использования в инъекционной форме [21]. Несмотря на интенсивные исследования в этой области, в настоящее время нет коммерческих продуктов, в которых бы использовали гидрогели в качестве подложки. В настоящем обзоре собрана актуальная информация, раскрывающая возможности восстановления хрящевой ткани с помощью трансплантации клеток на гидрогелевой подложке.

ИМПЛАНТАЦИЯ КЛЕТОК НА ПОДЛОЖКЕ/ГИДРОГЕЛЕ

При имплантации клетки могут быть дополнены биосовместимыми скаффолдами-матрицами, которые не только способствуют удержанию клеток в хрящевом дефекте, но и обеспечивают каркас для формирования структурированной гиалиноподобной ткани [22], содержат в своём составе БАВ, включают компоненты клеточного секретома или экзосомы [23, 24].

Использование гидрогеля в качестве матрицы является наиболее многообещающим методом лечения повреждённой хрящевой ткани, поскольку может заменить и упростить пересадку жёстких имплантатов минимально инвазивными инъекциями [25–28]. Гидрогели, широко использующиеся в тканевой инженерии, представляют собой сшитые трёхмерные гидрофильные полимерные биоматериалы с уникальными свойствами, такими как высокое содержание воды, биосовместимость, пористость, способность к биодеградации и пластичность [29, 30]. Свойства гидрогеля могут быть подобраны аналогично характеристикам ВКМ хряща, и его можно приготовить in situ. Следовательно, преимущества гидрогеля заключаются в меньшей инвазивности; в меньшем количестве осложнений (и соответственно более коротком пребывании пациента в стационаре); в формировании любой необходимой формы в соответствии с дефектом ткани [31, 32].

Считается, что идеальный каркас для регенерации хряща должен обеспечивать достаточную механическую прочность, контролируемую способность к биодеградации, адгезию и интеграцию с окружающей нативной тканью. При этом такой каркас должен имитировать естественные функции ВКМ, которые обеспечивают диффузию питательных веществ и способствуют выживанию и дифференцировке клеток [33]. Например, в исследовании in vitro МСК костного мозга, инкапсулированных в гидрогель хондроитин сульфат-тирамин-желатин (CS-Tyr/Gel), показана превосходная биоинтеграция на эксплантатах хряща. При этом умеренная механическая нагрузка стимулировала хондрогенную дифференцировку МСК [34].

Новое поколение гидрогелей представляет собой полимеры, которые можно вводить в организм в жидком состоянии, а затем превращать в гель за счёт воздействия различных стимулов in situ [35]. Наиболее важным преимуществом подобных материалов является доставка терапевтических агентов, в данном случае клеток, с минимальной инвазивностью.

Методы полимеризации гидрогелей in situ

Гидрогели на основе гиалуроновой кислоты (ГК) для инъекций обычно образуются посредством химического сшивания молекул (например, с помощью фотополимеризации, клик-реакции, реакции по типу Михаэля или Шиффа [27, 36], ферментативного сшивания) или после воздействия температуры/УФ-излучения. Однако следует отметить, что время воздействия УФ-излучения должно быть точно отрегулировано для достижения желаемых механических свойств без ущерба для жизнеспособности клеток [35], и это накладывает ограничения на использование данного метода.

Таким образом, механизм сшивания молекул in situ, приводящий к образованию гидрогеля, может быть физическим, физико-химическим или ферментативным. Трёхмерная сеть физических гидрогелей создаётся за счёт обратимых взаимодействий, таких как водородные связи, ионные силы и силы Ван-дер-Ваальса; ковалентных взаимодействий не происходит. Поскольку химические сшивающие агенты отсутствуют, физические гидрогели легко совместимы с биомолекулами и живыми клетками. Однако поскольку точки сшивания образуются за счёт слабых взаимодействий, данные гидрогели имеют низкую стабильность и плохие механические свойства. Обратимость их образования может быть полезной в тканевой инженерии, поскольку гидрогели способны реагировать на локальные изменения pH или концентрации веществ в организме, высвобождая инкапсулированные клетки и молекулы БАВ [37].

Некоторые полимеры, такие как агароза, каррагинан, желатин, эластин и коллаген, при изменении температуры переходят из жидкого состояния в твёрдое. Этот тип гидрогеля называется термочувствительным. Гелеобразование в нём происходит при повышении или понижении температуры. Температура перехода может быть верхней критической температурой раствора (ВКТР) или нижней критической температурой раствора (НКТР). Для полимеров с ВКТР гелеобразование происходит при температуре ниже ВКТР [38], в то время как для полимеров с НКТР гелеобразование происходит при температуре выше НКТР. В качестве инъекционных гидрогелей на основе термической сшивки в исследованиях использовали различные полимеры, такие как коллаген, агар, агароза, желатин, хитозан [39] и гиалуронан [40].

Основным преимуществом указанных систем является обратимость в конкретных приложениях, таких как доставка лекарств. Как только гидрогель оказывается внутри ткани, матрица разрушается под воздействием температуры тела, а клетки или БАВ высвобождаются из гидрогеля [37].

К физико-химическим способам образования гидрогеля относится фотоиндукция: при воздействии света две полимерные цепи ковалентно связываются в присутствии фотоинициаторов, которые, снижая энергию фотоактивации полимерных молекул, выступают в роли катализаторов фотохимической реакции. Реакции фотоиндуцированного сшивания обеспечивают сохранение формы гидрогелей и быстрое протекание реакции в условиях комнатной температуры. Однако интенсивность света, время воздействия и концентрация фотоинициатора являются ключевыми параметрами, которые могут повредить клетки. Известно, что длительное время воздействия и высокая интенсивность света повреждают ДНК. Ультрафиолетовый свет (290–320 нм) подходит для бесклеточных гидрогелей, поэтому видимый свет, например синий (405 нм) и зелёный (505 нм), исследуются в качестве альтернативы, поскольку их интенсивность схожа с ультрафиолетовым излучением, но при этом нет повреждающего воздействия [41]. Фотоинициатор должен быть нецитотоксичным и правильно взаимодействовать с молекулами гидрогеля при определённой длине волны. Несколько фотоинициаторов коммерчески доступны, одним из наиболее известных кандидатов считается эозин [42]. Наиболее распространёнными полимерами, используемыми в создании данной группы гидрогелей, являются полиэтиленгликоль (ПЭГ) [43], желатин [44] и гиалуронан [45].

Ферментативное сшивание — наиболее «мягкий» и совместимый с клетками процесс, так как не используются экзогенные реагенты с неизвестным эффектом на клетки [42]. Например, M.K. McHale и коллеги [46] синтезировали гидрогели для восстановления хряща на основе эластиноподобного полипептида (англ. elastin-like polypeptide, ELP) посредством поперечного связывания трансглютаминазой. Результаты показали высокую механическую прочность гидрогелей и сохранение фенотипа хондроцитов в течение 4-недельного периода культивирования, что свидетельствует о реструктуризации ELP за счёт экзогенной экспрессии компонентов ВКМ [46].

Примером гидрогеля, формирующегося in situ, может служить метакрилированный желатин, загруженный костным морфогенетическим белком 2 (англ. bone morphogenetic protein 2, BMP-2), факторами роста и МСК, где химическое сшивание запускается локальным воздействием УФ-излучения: жидкий раствор метакрилированного желатина может быть легко введён инъекционно, последующая УФ-фотополимеризация приводит к желаемой вязкости гидрогеля. В качестве гидрогеля также можно использовать термочувствительный разветвлённый сополимер ГК и поли(N-изопропилакриламид) (pNIPAM), который при комнатной температуре представляет собой водный раствор [11]. Многообещающие результаты получены на мышах и козах при использовании термочувствительного гидрогеля из гидроксипропилхитина [47].

Гибридные гидрогели

Синтетические гидрогели могут обеспечить более жёсткую структуру, обладают воспроизводимыми и более стабильными биомеханическими свойствами, что может быть использовано при получении гибридных гидрогелей. Например, N-акрилоилглюкозамин (AGA) добавляют в полиэтиленгликольдиакрилат (PEGDA); используют для приготовления гидрогелей и поливиниловый спирт. С другой стороны, относительно более мягкие гидрогели из натуральных материалов, таких как ГК и хондроитинсульфат (ХС), благоприятны для хондрогенеза при комбинированном использовании гидрогелей и клеток [11, 48].

Технология получения гибридных гидрогелей на основе ГК и декстрана (Декс), конъюгированного с тирамином (ТА), является многообещающим подходом к созданию продуктов для регенерации хряща. В исследованиях на животных показано, что гибридные гидрогели с 25% ГК-TA и 75% Декс-TA обладают высоким потенциалом в качестве инъекционных каркасов для регенерации хрящевой ткани [49]. Интересны комбинации гидрогелей не только с клетками, но и с фармакологически активными веществами. К примеру, в работах [50, 51] показано, что комбинация композитного гидрогеля с эпигаллокатехин-3-галлатом (EGCG), который, как известно, подавляет воспаление в различных типах клеток, включая хондроциты, оказывала противовоспалительный и хондропротективный эффекты на модели остеоартроза у мышей.

Хондроциты, инкапсулированные в ферментативно сшитую инъекционную биоразлагаемую гидрогелевую систему, включающую конъюгаты карбоксиметилпуллулан-тирамин (CMP-TA) и хондроитинсульфат-тирамин (ХС-TA), показали повышенную жизнеспособность и пролиферацию. При этом матрица ХС-TA сильнее повлияла на уровни экспрессии белков ВКМ (коллаген типа I, коллаген типа II и аггрекан), чем CMP-TA [52].

Показано, что местное введение быстро сшивающегося in situ гидрогеля на основе тиолированной ГК и гиперразветвлённого диакрилата полиэтиленгликоля (polyPEGDA) с МСК, полученными из жидкости для артроскопической промывки, способствует восстановлению поражений хряща у крыс [53]. Через 12 нед после имплантации в костно-хрящевой дефект у кроликов гидрогеля метакрилового желатина/метакрилатной ГК (mGL/mHA), нагруженного МСК костного мозга, наблюдалась регенерация хрящевой и субхондральной костной ткани [51, 54]. Хондроциты, инкапсулированные в гидрогель ГК/ПЭГ in situ, демонстрируют высокую метаболическую активность, жизнеспособность и пролиферацию [55]. В свою очередь хондроциты, инкапсулированные в гидрогель хитозан-ГК с использованием метакрилированного гликольхитозана, демонстрировали превосходную пролиферацию и повышенную экспрессию ВКМ [56]. На новозеландских кроликах показано, что имплантация аутологичных хондроцитов на подложке из коллагена типа I/III Chondro-Gide или на синтетической мембране из полиэфирсульфона восстанавливает повреждённый гиалиновый хрящ [57].

В работе [58] авторы помещали хондроциты в инъекционный гидрогель, состоящий из хитозана, ГК, силанизированной гидроксипропилметилцеллюлозы (Si-HPMC). Хондроциты хорошо пролиферировали, способствуя заживлению дефектов хряща на моделях крыс in vivo. Исследовали инъекционный гидрогель из ГК, полиакриловой кислоты и глутатиона с магнитными частицами. Хондроциты, иммобилизованные в данный гидрогель, пролиферировали и дифференцировались в месте повреждения хряща за счёт магнитного взаимодействия наночастиц железа и адгезии рецепторов CD44 на цепи ГК. Дефект хряща кролика регенерировал в однородный и гладкий хрящ через 8 нед после имплантации гидрогеля, а столбчатое расположение хондроцитов в глубоких слоях ткани было сходным с расположением хондроцитов в нативной ткани [59].

S. Fattahpour и соавт. [60] разработали и охарактеризовали инъекционные гидрогели метилцеллюлоза-карбоксиметилцеллюлоза-плюроник и ZnCl₂, содержащие мелоксикам. Данные гидрогели способствовали адгезии и пролиферации хондроцитов. В другом исследовании [61] фотосшиваемый инъекционный гидрогель серицин метакрилоил (Sericin methacryloyl), нагруженный хондроцитами через 8 нед после имплантации, успешно сформировал хрящ у кроликов. При этом регенерированный хрящ имел структуру естественной ткани.

Кроме того, были изучены инъекционные гидрогели с флуоресцентной маркировкой (англ. fluorescently labeled injectable hydrogels, FLIH) для наблюдения восстановления хряща в динамике. Согласно исследованию C. Onofrillo с соавт. [62], FLIH считается хорошим инструментом для мониторинга изменений инъекционных фотосшиваемых гидрогелей в структуре хрящевой ткани после введения. Продукция ВКМ после применения инъекционных гидрогелей прямо пропорционально связана со снижением флуоресценции, которая описывает скорость деградации гидрогеля. FLIH могут быть использованы в качестве системы мониторинга в реальном времени, подходящей для оценки хондрогенеза [32].

Другой биополимер — целлюлоза, состоящая из повторяющихся звеньев 1,4-β-гидроглюкозы, соединённых β-эфирными связями, перспективен для применения в биомедицине из-за растворимости в воде продуктов деградации [63–65]. Различные производные целлюлозы были исследованы для биомедицинского применения. Например, упомянутая выше HPMC (гидроксипропилметилцеллюлоза) представляет собой водорастворимую форму эфира целлюлозы, которая широко используется в биомедицине благодаря своей биосовместимости и стабильности в широком диапазоне температур и рН. Однако жёсткость гидрогеля не соответствует нативному хрящу (фундаментальное требование при создании идеального каркаса для клеток). Для преодоления данной проблемы использовали лапонит, который представляет собой силикатную глину. Наночастицы лапонита обладают отрицательным и положительным зарядом на разных гранях, образуя сети с гидрогелем Si-HPMC с контролируемыми свойствами гелеобразования. Нанокомпозит показал улучшенные механические свойства при сохранении биосовместимости и хорошей диффузии кислорода. Гидрогели Si-HPMC как с лапонитом, так и без него смешивали с хондроцитами человека и вводили подкожно в холку самкам мышей Nude. Дальнейший гистологический анализ выявил наличие зрелых хондроцитов, которые были расположены в лакунах, окружённых базофильным матриксом, при этом клетки в скоплениях секретировали компоненты ВКМ [65, 66].

В другом исследовании при оценке эффективности восстановления хряща в эксперименте на собаках выявлено, что гидрогель на основе силилированной целлюлозы и хитозана с добавлением стромальных клеток жировой ткани почти полностью заполнил дефект гиалиновой хрящевой тканью. При этом бесклеточный гидрогель показал сопоставимый регенеративный эффект. В группе контроля дефекты были лишь частично заполнены фиброзной тканью [67]. В сочетании с альгинатом натрия наноцеллюлоза использовалась для создания гидрогелей и показала хорошие механические свойства, интеграцию и регенерацию хряща у мышей [68–70].

Гидрогель ПЭГ, содержащий фактор роста TGF-β3 и хондроциты, также является многообещающей матрицей для регенерации гиалинового хряща. При подкожной имплантации мышам Nude данного гидрогеля показано, что образовавшийся ВКМ содержит больше аггрекана, декорина, бигликана, коллагена II типа, чем после инъекции гидрогеля без добавления TGF-β3 [71]. Описанный эффект закономерен, поскольку TGF-β3 — один из наиболее важных белков, влияющих на хондрогенез. Взаимодействуя непосредственно с рецепторами на поверхности клеточной мембраны, это белок запускает каскад молекулярных взаимодействий с участием транскрипционного фактора Sox9 через каскад Smad, стимулируя экспрессию генов белков ВКМ [32, 72, 73].

В другом исследовании хондроциты после 3D-культивирования в присутствии TGF-β3 формировали хрящевую ткань in vitro и in vivo [74]. Применение 3D-структур может оказаться более эффективным, поскольку синтез и секреция компонентов ВКМ в данном случае начинается ещё до имплантации в организм, что закономерно должно ускорить процесс интеграции продукта в хрящевую ткань.

Подложки с лизатом тромбоцитов или фибрином

Гидрогели можно «нагружать» не только отдельными цитокинами, такими как TGF-β3, но и очень сложными биологически активными смесями. Так, подложки с лизатом тромбоцитов (ЛТ) совсем недавно были исследованы для регенерации хрящей и костей, а также для заживления ран. ЛТ содержит, помимо основных белков, таких как альбумин и фибриноген, коктейль из факторов роста и других БАВ. В исследованиях было показано, что ЛТ потенцирует пролиферацию клеток, их миграцию, а также хондрогенную дифференцировку. Концентраты тромбоцитов уже длительное время используются в медицине из-за их доступности, экономичности и аутологичной природы [75].

Показано, что инъекционный гидрогель из ГК и трамина, содержащий ЛТ, является простым в применении подходом и может использоваться в качестве подложки для клеток [8]. Кроме того, за счёт способности к гелеобразованию и наличия факторов роста в составе, PRP может применяться в качестве компонента для подложек из различных материалов [76, 77].

Многие исследования продемонстрировали потенциальную эффективность и отличную биосовместимость PRP для восстановления дефектов хряща [78]. ЛТ представляет собой естественный пул факторов роста, состоящий из TGF-β1, TGF-β3, IGF-1 и VEGF, и может быть получен из PRP. Благодаря удалению фрагментов тромбоцитов градиентным центрифугированием иммуногенность ЛТ ниже, чем у PRP [79]. Показано, что гидрогель с ЛТ и гепарином способствовал восстановлению хряща у крыс с моделированным артритом коленного сустава [32, 80].

Результаты исследований in vivo обнадёживают, указывая на то, что имплантаты на основе фибрина являются достойным вариантом лечения повреждений хряща с помощью тканевой инженерии [27, 81, 82]. Так, фибриновый клей и аутологичные тромбоциты с добавлением МСК костного мозга эффективно регенерировали хрящ в эксперименте на лошадях, однако и бесклеточный продукт также показал свою эффективность [68, 83].

ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ

Существует множество нерешённых вопросов относительно оптимальной техники восстановления хряща на основе клеток, клинические исследования продолжаются во многих странах [68, 84]. Не установлено явного превосходства одного метода над другим, опубликованные исследования различаются по своему качеству, а большинство статей являются описанием серий случаев [18] или экспериментов на животных [27, 68]. При этом методы оценки эффективности используемых методов лечения также разнятся между собой. Например, не регламентирован важный параметр длительности культивирования клеток в монослое или в 3D-культуре [18, 85]. На сегодняшний день биомедицинским сообществом отмечается, что данную проблему можно решить комплексным подходом с использованием клеточных технологий, новых материалов, методов генетической инженерии, ростовых факторов и гормонов, лекарственных препаратов [86–88].

Инъекционные гидрогели, которые является основным направлением развития биоинженерии хрящевой ткани не только благодаря бионическим свойствам, сходным с ВКМ хряща из-за высокого содержания воды, но также из-за минимально инвазивного способа введения и высокой пластичности, находятся в приоритете. Для улучшения биомеханических свойств инъекционных гидрогелей в них добавляют различные полимерные смеси, а для изменения механических свойств используют многие нанокомпозитные материалы [32]. Интеграция клеток и цитокинов или других БАВ в гидрогели может улучшить интеграцию гидрогелей в ткань и способствовать регенерации хряща [71, 77].

В большинстве работ по получению скаффолдов с клетками для регенерации хряща исследователи использовали культуры аутологичных хондроцитов. В ряде случаев из-за ограниченного количества клеточного материала требуется длительное культивирование, при котором имеется риск потери клетками хондрогенных свойств и их дифференцировки в фибробласты, что может привести к фиброзу после трансплантации [89–91]. Аутологичные хондроциты в основном получают из хряща ненагруженной области сустава, что может привести к излишнему повреждению донорского участка [32, 92].

Несмотря на то, что клеточные продукты на основе аутологичных хондроцитов для восстановления хрящевой ткани уже присутствуют на медицинском и биотехнологическом рынках, пока они больше направлены на коррекцию незначительных повреждений суставных хрящей и не покрывают всю потребность сообщества пациентов с серьёзными патологиями суставов или пороками развития с учётом степени тяжести воспалительно-дегенеративного процесса. В частности, при появлении остеофитов и (в тяжёлых случаях) — при деформации сустава применение клеточных технологий может быть ограничено. Более того, часто в силу ряда причин невозможно получить в достаточном количестве аутологичные хондроциты для создания полноценного хрящевого импланта (например, в случае длительной глюкокортикоидной терапии). В последнее время также появляются данные о нецелесообразности использования клеточного материала, полученного от пациентов с рядом патологий хрящевой ткани, при изготовлении клеточных продуктов для терапии в связи со сниженной функциональностью хондроцитов. Кроме того, при некоторых наследственных патологиях совсем невозможно получить функциональный клеточный материал.

В связи с этим индуцированные плюрипотентные клетки (ИПСК) являются многообещающим и ёмким источником для получения различных дифференцированных производных, в том числе хондроцитов. Однако данные об их безопасности и способности формировать полноценную функционально-активную хрящевую ткань достаточно ограничены, а касаемо иммуногенности — противоречивы. Кроме того, получение аутологичных ИПСК — это длительный и дорогостоящий процесс, затрудняющий внедрение продуктов на их основе в медицинскую практику, а несовершенство протоколов дифференцировки пока не позволяет получать культуры хондроцитов в «чистом» виде [93]. Однако есть патологии, при которых совсем нет смысла использовать аутологичный материал. Например, при наследственных формах хондродисплазии, которые часто проявляются в раннем детстве как лёгкие или тяжёлые нарушения скелета из-за мутаций в генах, ответственных за формирование компонентов хряща [93]. В этом случае наиболее вероятным способом становится или генная терапия, или использование аллогенных дифференцированных производных стволовых клеток, либо комбинация двух технологий. Неоднозначность в этом вопросе вносят и появляющиеся публикации о пониженном хондрогенном потенциале дифференцированных производных ИПСК, взятых от пациентов с остеоартритом, по сравнению с ИПСК здоровых доноров, что несёт в себе риски получения клеточного продукта, обладающего потенциально меньшей терапевтической эффективностью.

Перспективным подходом представляется создание и применение для этих целей аллогенных ИПСК с пониженной иммуногенностью, универсальных для всех реципиентов. Такие линии после валидации их плюрипотентного статуса можно использовать для дифференцировки в различные типы клеточных производных, так называемых продуктов off-the-shelf, в том числе на основе хондроцитов, с целью последующего создания клеточных и тканеинженерных продуктов для трансплантации. Такие линии ИПСК могут решить основную проблему дефицита донорского материала, когда его невозможно получить от пациента по показаниям или при наличии серьёзной патологии. Вместе с тем нельзя сбрасывать со счёта и высокий риск туморогенеза или повышенной пролиферации гипоиммуногенных ИПСК и их производных, что может нарушать нормальное функционирование ткани при трансплантации. Подходы к снижению таких рисков только начинают разрабатываться в последние годы, и до применения в клинике таких «универсальных» линий необходимы многочисленные исследования их биобезопасности и эффективности как in vitro, так и на животных [94]. В связи с этим проведение сравнительных исследований полноценной функциональности и структуры полученных хрящеподобных конструкций из различных клеточных источников становится актуальным и необходимым шагом для дальнейших работ по разработке тканеинженерных конструкций и стратегий их применения для нужд регенеративной медицины. В конечном итоге мы получим ответ на вопрос — какой биологический источник клеток позволяет получить безопасную и наиболее приближенную по структуре и функциональной активности к нативной хрящевой ткани конструкцию. Более того, омиксные подходы позволят определить ключевые факторы, которые отвечают за дифференцировку или поддержание дифференцированного состояния, что будет способствовать оптимизации существующих протоколов по получению клеточных продуктов на основе культур хондроцитов разного генеза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящий момент наметилась тенденция оптимизации технологий получения клеточных или тканеинженерных конструкций в сторону комбинации клеточных источников, таких как хондроциты или МСК, с матрицами, содержащими молекулы ВКМ и факторы роста для стимуляции регенерации ткани, а также медицинских подходов к их применению. Пока такие методы лечения не стали общедоступными, необходимо оценить использование существующих технологий, чтобы определить наиболее эффективные и сравнительно недорогие в производстве и применении. Многие данные свидетельствуют о том, что имплантация хондроцитов на подложке предпочтительнее, чем нативных клеток. Однако недостаток сравнительных исследований в данной области располагает к дальнейшим поискам. Кроме того, необходимы эксперименты для подтверждения преимуществ конкретных клеточных продуктов как при различных степенях поражений хрящевой ткани, так и при разных патологиях. Дальнейшие клинические исследования, в том числе рандомизированные контролируемые испытания, определят истинную клиническую эффективность клеток с гидрогелями при восстановлении хряща.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Данная публикация выполнена в рамках государственного задания № 122032300191-2 «Органоид-22».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Наибольший вклад распределён следующим образом: П.А. Голубинская — обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, редактирование статьи; А.С. Пикина — подготовка и написание текста статьи; Е.С. Ручко — поиск литературы; Т.В. Владимирова — поиск литературы; А.В. Еремеев — редактирование текста статьи; А.Н. Богомазова — финальное редактирование и правка. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

ADDITIONAL INFORMATION

Source of financing. This publication was carried out within the framework of the state task No. 122032300191-2 “Organoid-22”.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. The greatest contribution is distributed as follows: P.A. Golubinskaya — literature review, collection and analysis of literary sources, editing of the article; A.S. Pikina — preparation and writing of the text of the article; E.S. Ruchko — literature search; T.V. Vladimirova — literature search; A.V. Eremeev — editing, A.N. Bogomazova — final editing and editing. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors have made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication).

About the authors

Polina A. Golubinskaya

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Author for correspondence.
Email: polinapigeon@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1765-9042
SPIN-code: 5299-9693

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow

Arina S. Pikina

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Email: arina.pikina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8967-2318
SPIN-code: 8654-7318
Russian Federation, Moscow

Eugene S. Ruchko

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Email: ruchkoevgeny@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1361-666X
SPIN-code: 7220-6031
Russian Federation, Moscow

Tatyana V. Vladimirova

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Email: tat.vlad24@gmail.com
ORCID iD: 0009-0001-9266-2065
Russian Federation, Moscow

Alexandra N. Bogomazova

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Email: abogomazova@rcpcm.org
ORCID iD: 0000-0003-1549-1984
SPIN-code: 8093-8009

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow

Artem V. Eremeev

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Email: art-eremeev@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3428-7586
SPIN-code: 4825-5440

PhD; Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files