MODEL OF TOXIC FIBROSIS IN WISTAR RATS: MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR-GENETIC PARAMETERS OF THE TRANSITION POINT TO CIRRHOSIS

Full Text

Введение

Цирроз печени входит в группу 11-ти лидирующих болезней, приводящих к наиболее частой смерти людей во всем мире [1, 2]. Однако, эффективная антифибротическая терапия не разработана [3, 4].

Принято считать, что хронической печеночной недостаточности предшествует четыре стадии: воспаление, фиброз, цирроз и терминальная стадия заболевания и/или гепатоцеллюлярная карцинома [2, 5]. Анализ научной литературы показал, что механизмы, определяющие переход от фиброза к необратимому состоянию, недостаточно изучены. На существующих экспериментальных моделях животных большинство авторов изучают конкретные, далеко отстоящие друг от друга ключевые позиции – печень в норме, фиброз и цирроз, либо фиброгенез не на всем протяжении времени. При этом значительная часть информации по разным причинам не фиксируется [6, 7, 8, 9, 10].

Мы предположили, что точка перехода фиброза печени в цирроз будет иметь исключительные патоморфологические и молекулярно-генетические особенности. За основу были взяты следующие патоморфологические критерии: нарушение пластинчатого строения паренхимы, разрастание фиброзной ткани, лимфоидно-гистиоцитарная инфильтрация и нарушение кровообращения [11, 12, 13]. Представляется целесообразным исследовать в качестве молекулярных мишеней ключевые гены, отвечающие за эти процессы. Приведенным выше критериям соответствовали шесть генов: tweak (tnfsf12), fn14 (tnfrsf12a), ang, vegfa, cxcl12 (sdf) и mmp-9 [14, 15, 16, 17, 18, 19, 20].

Прогрессирование фиброза происходит с участием паренхиматозных, непаренхиматозных клеток печени и пришлых, инфильтрирующих орган клеток [21, 22, 23]. Для исследования были выбраны: жиронакапливающие клетки (звездчатые клетки печени, липоциты, перисинусоидные клетки, клетки Ито, перициты, стеллатные клетки) и портальные фибробласты – основные источники секреции межклеточного вещества; три субпопуляции макрофагов (тканевые, костномозгового происхождения, активированные по альтернативному противовоспалительному M2-фенотипу); гемопоэтические стволовые клетки.

Цель

Вышеизложенное определило цель настоящего исследования – изучить морфологические и молекулярно-генетические изменения печени крыс Wistar при узловой перестройке паренхимы.

Материалы и Методы

Экспериментальное исследование

В рамках настоящей работы при описании генов применяли названия терминов, принятые в Guidelines for Nomenclature of Genes, Genetic Markers, Alleles, and Mutations in Mouse and Rat (http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/gene.shtml).

Дизайн исследования был одобрен на заседании Комиссии по биоэтике и гуманному обращению с лабораторными животными при учреждении образования «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет» (протокол № 6 от 03.01.2019). Все манипуляции с животными проводили в соответствии с рекомендациями Конвенции Совета Европы по охране позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях от 18.03.1986, Директиве Совета ЕЭС от 24.11.1986 и рекомендациям FELASA Working Group Report (1994-1996).

Фиброз и цирроз печени у крыс-самцов Wistar индуцировали свежеприготовленным раствором тиоацетамида (ТАА; Acros Organics, Бельгия), который вводили интрагастрально через зонд в дозе 200 мг/кг массы тела 2 раза в неделю в течение 13 нед. Крысы контрольной группы получали воду без ТАА в аналогичном объеме. Животных рандомизировали на 3 группы (n=12 в каждой): 9 нед (1-я группа), 11 нед (2-я группа), 13 нед (3-я группа).

Гистологическое, иммуногистохимическое и морфометрическое исследование.

После декапитации под кратковременным эфирным наркозом с применением гильотины из большой левой доли печени крыс забирали образцы диаметром 5-10 мм, которые помещали в 10%-ный раствор нейтрального формалина (Биовитрум, Россия) на фосфатном буфере и фиксировали в течение 24 ч. Затем проводили обработку фиксированного материала с последующей заливкой в парафин с использованием автомата для гистологической обработки ткани STP-120 (Thermo Fisher Scientific, Германия) и станции для заливки ткани парафином EC350 (Thermo Fisher Scientific, Германия). От каждого животного получали по одному блоку для каждого метода окрашивания и с помощью микротома НМ340Е (MICROM, Laborgerate GmbH, Германия) готовили в среднем по 3-4 среза толщиной 4 мкм и помещали их на предметные стекла. Для получения обзорных гистологических препаратов срезы печени окрашивали гематоксилином и эозином, а для выявления соединительной ткани – по Маллори с помощью автомата для окраски HMS70 (Thermo Fisher Scientific, Германия). Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах [24]. Список маркеров представлен в табл. 1.

В работе применяли антитела производства Wuman Elabscience Biotechnology Incorporated Company, набор 2-step plus Poly-HRP Anti Rabbit/Mouse IgG Detection System/with DAB Solution; Retrieve-All Antigen (Unmasking System Basic), буфер для разведения антител (BioLegend), Твин-20 (Glentham Life Sciences), PBS (Melford). Для лучшей ориентации в препарате и правильной идентификации клеток, содержащих искомый антиген, срезы докрашивали гематоксилином Майера в течение 1 мин. Для объективной интерпретации результатов для каждой исследуемой серии (группы животных) использовали положительный и отрицательный контроли. Иммуногистохимическую окраску оценивали как положительную только при отсутствии окрашивания в отрицательном контроле и, наоборот, как отрицательную при окрашивании в положительном контроле.

Гистологические препараты исследовали с использованием компьютерных программ ImageScope Color и cellSens Standard на базе микроскопа Olympus BX51 (Япония). Количество α-SMA⁺-клеток, FAP⁺-клеток, CD68⁺-клеток, CD206⁺-клеток, СХ3СR1⁺-клеток, CD45⁺-клеток, междольковых вен и синусоидных капилляров подсчитывали в трех полях зрения каждого гистологического среза при увеличении объектива 40×. Измеряли площадь междольковых вен и междольковых артерий в мкм². Степень фиброза определяли с использованием полуколичественной шкалы K.G. Ishak [25].

Оценка уровня мРНК tweak, fn14, ang, vegfa, cxcl12, mmp-9. Фрагменты печени диаметром не более 5 мм, помещали в криопробирки и далее в жидкий азот для хранения до начала процедуры выделения суммарной РНК. Общую фракцию РНК выделяли согласно инструкции производителя набора «АртРНК MiniSpin» (АртБиоТех, Беларусь). Контроль качественных характеристик образцов выполняли с помощью электрофореза в агарозном геле (выборочно) без денатурирующих условий (однократный трис-ацетатный буфер, 2 %-й агарозный гель). Количество суммарной РНК после выделения определяли с помощью спектрофотометрии (длина волны – 260 нм, спектрофотометр Specord 250 (Analytic Jena, Германия)). Выборочно снимали спектр поглощения 220–340 нм.

Синтез кДНК проводили с использованием олиго дТ праймеров и набора реагентов ArtMMLV Total (АртБиоТех, Беларусь) в соответствии с инструкцией производителя. Для каждой реакции использовали 200 нг общей фракции РНК. Выбор олигонуклеотидных праймеров и зондов для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) осуществили с помощью бесплатного онлайн приложения Primer3 v. 0.4.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)). Перечень выбранных молекулярных мишеней, референсный ген и последовательности олигонуклеотидных праймеров представлены в табл. 2 и табл. 3.

ПЦР-РВ проводили с использованием реагентов производства компании «Праймтех», Беларусь. Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл и содержал все необходимые компоненты в следующих концентрациях: 2 мМ хлорида магния, 0,1 мМ смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов, 500 нМ олигонуклеотидов, включая зонд для ПЦР-РВ, 1,25 ед. термостабильной Taq ДНК-полимеразы с соответствующим буферным раствором. Режим термоциклирования: +95^оС – 2 минуты, затем 40 циклов: +95^оС – 5 сек, +60^оС – 45 сек. Детекция по каналу FAM после каждого цикла. В работе использовали прибор CFX96touch (BioRad, США). Эффективность реакций определяли с помощью метода стандартной кривой и серий разведений, концентрированных образцов кДНК. Для каждого образца биологического материала ПЦР-РВ проводили в трех повторах. В каждой экспериментальной и контрольной группах все 12 образцов анализировали отдельно для получения наибольшей достоверности и учета внутригрупповой вариации, фенотипической гетерогенности уровня экспрессии генов.

Эффективность реакций, а также абсолютное число копий, соответствующих мРНК, оценивали методом стандартной кривой. Относительный уровень экспрессии мРНК определяли с помощью метода . Эффективность всех реакций варьировала менее чем на 5% и составила 94-97%.

Статистический анализ. Результаты количественных измерений оценивали с использованием программ Statistica 10.0 (StatSoft, Inc.), Microsoft Office Excel (Microsoft Corp.). Для каждой выборки определяли нормальность частотного распределения каждого признака. Выборки не являлись малыми (n=60>50), поэтому проверку осуществляли по критерию Лиллиефорса. Данные представлены в виде средних арифметических (М) и их соответствующих доверительных интервалов (95%ДИ), медианы и значения 15-го и 85-го процентилей (Ме (15%; 85%)). Об уровне статистической значимости различий изучаемых признаков в группах с нормальным распределением данных судили по t критерию Стьюдента; в случае отличия выборок от нормального распределения использовали U критерий Манна-Уитни. Для выявления корреляции между изучаемыми признаками и ее силы использовали непараметрическую ранговую корреляцию Спирмена. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05, если точное значение р не указано.

Результаты

Патогистологическая характеристика печени крыс при узловой перестройке паренхимы

Морфология паренхимы печени контрольных крыс соответствовала критериям нормы (рис. 1А, F0).

По истечении 9-ти нед эксперимента вблизи отдельных триад имело место начало процесса узелковой трансформации паренхимы с образованием единичных ложных печеночных долек (рис. 1Б, F4/F5). Отметили выраженное фиброзное расширение всех портальных зон (портальный и перипортальный фиброз) с полностью сформированными порто-портальными септами (мостовидный фиброз) и диффузный перицеллюлярный фиброз. Площадь соединительной ткани к общей площади гистологического среза увеличилась в 4,7 раза (p<0,00001) по сравнению с контрольной группой. При дальнейшей интоксикации крыс (11 нед, F5 – неполный цирроз, рис. 1В) на гистологических препаратах наблюдали диффузную узловую перестройку паренхимы печени и значительное разрастание фиброзной ткани вокруг портальных зон. Ее площадь возросла в 6,0 раз (p<0,00001) по сравнению с контролем. К концу эксперимента (13 нед, F6 – достоверный цирроз, рис. 1Г) выявили тотальное поражение печени, характеризующее образование ложных печеночных долек различной формы и диаметра, диффузный перицеллюлярный фиброз. Площадь соединительной ткани увеличилась в 7,4 раза (p<0,00001) по сравнению с контрольной группой. В триадах, фиброзных септах и реже в паренхиме наблюдали клетки лимфоидно-гистиоцитарного инфильтрата. В паренхиме печени не отмечали прогрессирование дистрофических процессов, увеличением зон некроза и некробиоза гепатоцитов, жировую дистрофию.

Сосудистые изменения печени крыс в ходе эксперимента

В условиях физиологической нормы в портальных зонах количество междольковых артерий была равным 2,50 (1,00;5,00), междольковых вен – 2,91 (1,00;5,00), синусоидных капилляров – 34,80 (29,00;43,00). Изменения количества данных сосудов показано на рис. 2.

На начальной стадии трансформации фиброза печени в цирроз (F4/F5) количество междольковых вен увеличилось в 4,8 раза (p<0,00001), а синусоидных капилляров было снижено в 1,6 раза (p<0,00001) по сравнению с контрольной группой. Прогрессирование фиброза печени (F5) сопровождалось увеличением количества междольковых вен (в 6,0 раз, p<0,00001) и снижением синусоидных капилляров (в 1,8 раза, p<0,00001) по сравнению с контрольной группой. На стадии цирроза морфометрический анализ выявил увеличение количества междольковых вен в 8,0 раз (p<0,00001) и снижение синусоидных капилляров в 2,2 раза (p<0,00001) по сравнению с контролем.

Установили увеличение площади междольковых вен в 6,13 раза (p<0,00001, 9 нед), в 7,00 раз (p<0,00001, 11 нед) и в 18,00 раз (p<0,00001, 13 нед) по сравнению с контрольной группой (рис. 3А, 3Б). В большинстве случаев междольковые вены приобретали гигантский размер (рис. 3В).

При этом, на всех этапах эксперимента количество междольковых артерий сохранилось на прежнем уровне (р=0,9994). В портальных зонах и фиброзных септах наблюдали выраженный венозный ангиогенез (рис. 3Г).

Изменения клеточного состава печени

Клетки, экспрессирующие маркеры FAP, α-SMA, CD206, CX3CR1, CD45 в печени контрольных крыс, практически отсутствовали. CD68⁺-клетки крыловидной формы (тканевые звездчатые макрофаги, клетки Купфера) наблюдали преимущественно в синусоидных капиллярах и небольшое их количество отмечали около центральных вен и междольковых сосудов. Изменение количества исследуемых популяций клеток на различных этапах исследования представлены в табл. 4.

В печени крыс выявлены две популяции миофибробластов, экспрессирующие различные маркеры и расположенные в разных зонах печени. На всех этапах эксперимента α-SMA⁺-клетки определяли преимущественно в синусоидных капиллярах, очагах некроза и соединительнотканных септах (рис. 4А). FAP⁺-клетки располагались в портальных зонах, фиброзных трабекулах и реже в синусоидных капиллярах (рис. 4Б). CD206⁺-клетки округло-вытянутой формы в основном выявлялись в синусоидных капиллярах в виде цепочек на всех этапах эксперимента (рис. 4В). CX3CR1⁺-клетки округлой формы локализовались главным образом в портальных зонах (рис. 4Г). Встречались участки срезов печени с отчетливой миграцией CX3CR1⁺-клеток из просвета сосуда в паренхиму. CD45⁺-клетки отмечали в основном в триадах и септах грубоволокнистой фиброзной ткани.

Экспрессия мРНК генов tweak (tnfsf12), fn14 (tnfrsf12a), ang, vegfa, cxcl12 (sdf) и mmp-9

На 9-й, 11-й и 13-й нед эксперимента уровень мРНК генов мишеней, за исключением mmp-9/13 нед, статистически значимо изменился по сравнению с контрольной точкой (р<0,001). При этом направленность этих изменений в зависимости от мишени носила различный характер (рис. 5).

Уровень мРНК генов ang, cxcl12 и tnfsf12 (tweak) – изначально пониженный по сравнению с контрольной группой (p<0,001 для всех), также статистически значимо (р<0,001, p = 0,013, p<0,001 соответственно) снизился к 11-й нед эксперимента по сравнению с 9-й нед. В отличие от них уровень мРНК tnfrsf12 (fn14) и mmp-9 изначально возрос по сравнению с контрольной точкой (p<0,001 для всех). Однако, по сравнению с 9-й нед также снизился к 11-ой нед (p<0,001 и p=0,028 соответственно). Альтернативно отреагировал на события, развивающиеся на 11-й нед эксперимента ген vegfa. Аналогично ang, cxcl12 и tnfsf12 уровень его мРНК снизился к 9-й нед по сравнению с контрольной группой. Тем не менее к 11-й нед он не статистически значимо возрос (порядка 10%).

В ходе развития фиброза и перехода его в цирроз изменения затрагивали как силу взаимосвязи между уровнем мРНК генов-мишеней, так и собственно наличие этих связей (рис. 6).

В норме ключевую позицию занимает tweak, в то время как на стадии развитого фиброза наблюдается переход акцента на cxcl12. Далее в точке перехода фиброза в цирроз наблюдается максимальная взаимосвязь между уровнем мРНК всех генов-мишеней. Напротив, после завершения перехода – на стадии цирроза практически все связи разрываются или ослабевают. 

Обсуждение

В современной научной литературе практически отсутствует морфологическая и молекулярно-генетическая характеристика процесса перехода фиброза печени в цирроз. Большинство авторов при изучении фиброгенеза в основном выделяют от 3-х до 5-ти, по их мнению, ключевых точек. Исследуя цирроз печени в 9-ти временных точках, нам представилось возможным отследить плавное нарастание прогрессии патогистологических изменений и рассмотреть фиброз постадийно [27]. Мы обратили внимание на то, что период с 9-й по 13-ю нед имеет исключительные морфологические (темпы разрастания фиброзной ткани, смена фенотипического состава и количества клеток) и молекулярно-генетические особенности (изменение уровня экспрессии мРНК) по сравнению с остальными сроками эксперимента.

В рамках настоящей работы представляет интерес тот факт, что период перестройки паренхимы печени (F5, 11 нед) не сопровождался прогрессированием дистрофических процессов, увеличением зон некроза и некробиоза гепатоцитов. Жировую дистрофию не выявили ни на одной из стадий фиброза и цирроза. При сравнении показателей площади соединительной ткани 9-й нед и 11-й нед между собой достоверных отличий не выявили (р=0,7912). Количество α-SMA⁺- и FAP⁺- клеток, как основных продуцентов соединительной ткани в этот период, так же не изменилось (р=0,2073 и р=0,3775 соответственно). При этом достоверный цирроз сопровождался ростом α-SMA⁺- и FAP⁺-клеток в 1,50 раза (p<0,00001) по сравнению с 9-й нед. Большинство авторов сообщают о постоянном росте числа α-SMA^+- клеток [28]. Сведения о FAP⁺- клетках не многочисленны и изучались они в основном при холестатических поражениях печени [23].

По данным ряда исследователей, клетки, экспрессирующие маркер CD68, являются резидентными звездчатыми макрофагами/клетками Купфера, обладают пластичностью, изменяя свой фенотип в ответ на сигналы микрокружения (M1-фенотип, провоспалительные классически активированные и M2-фенотип, противовоспалительные альтернативно активированные) [21, 22]. В настоящей работе отличия по количеству CD68⁺-клеток выявлены только на стадии F4/F5 (в 2,0 раза выше, p<0,00001). При этом число CD206⁺- клеток (М2 фенотип) на трех сроках эксперимента на изменилось (р=0,6415). Возможно, при узловой перестройке паренхимы смена микроокружения приводит к трансдифференцировке CD68⁺-клеток в M1-провоспалительный фенотип или сам процесс дифференцировки в M2- противовоспалительный фенотип, по каким-то причинам замедляется/блокируется или CD68⁺-клетки выполняют другую роль, которую еще предстоит изучить. Не отмечены изменения и по количеству CX3CR1⁺- клеток (макрофаги костномозгового происхождения, р=0,9983) и CD45⁺-клеток (гемопоэтические стволовые клетки, р=0,9999). Предположительно, в печени срабатывают регенераторные, компенсаторно-приспособительные и/или иные процессы, сдерживающие приток данных клеток из костного мозга.

Фиброгенез печени сопровождается патологическим ангиогенезом, но его роль в прогрессировании фиброза и цирроза до сих пор остается в центре внимания ученых [29].

В портальных зонах и фиброзных соединительнотканных септах мы установили выраженный патологический венозный ангиогенез. Полученные нами результаты противоречат данным одних авторов [29] и согласуются с другими [30]. При фиброзе печени мышей, вызванного четыреххлористым углеродом, отмечают снижение количества портальных сосудов, при этом не уточняя касательно вен или артерий, и увеличение центральных вен [29]. Процесс перестройки паренхимы и формировании ложных печеночных долек характеризовалось практически полным отсутствием на гистологических препаратах центральных вен. Предположительно, это связано с формированием порто-центральных и центро-центральных фиброзных септ, содержащих анастомозы, через которые происходит сброс крови, минуя паренхиму. Выявленное снижение количества синусоидных капилляров связано с уменьшением количества гепатоцитов и увеличением фиброзно-тканевого компонента в печени. Представляет фундаментальный интерес установленное нами отсутствие изменений со стороны междольковых артерий. Стенка артерий имеет более сложное строение по сравнению с венами и, предположительно, вены быстрее подвергаются морфологической перестройке. Возможно, артерии выступают в роли инициатора венозного ангиогенеза. Они запускают процесс формирования микроваскулогенной сети, а она затем перестраиваются в венулы. Это требует проведения дальнейших исследований. В работах, посвященных ангиогенезу при фиброзе печени, практически не упоминается об изменении площади междольковых вен. Вероятно, расширение диаметра междольковых вен способствует формированию патологического портального венозного ангиогенеза. При сравнении показателей количества синусоидных капилляров (р=0,7985), число междольковых вен (р=0,3070), площадь междольковых вен (р=0,9999) 9-й нед и 11-й нед между собой отличий не выявлено.

Переход фиброза печени в цирроз сопровождался изменением уровней экспрессии генов-мишеней, а также наличием и силой взаимосвязи между ними. Между генами tweak, fn14, ang, vegfa, cxcl12 и mmp-9 вывили значимые корреляционные связи r=0,5-0,84 (р<0,01).

В группе контрольных животных наибольшее число связей установлено для гена tweak. Белок-лиганд TWEAK сигнального пути TWEAK/Fn14 широко распространен в тканях и может встречаться как в свободной, так и в связанной с мембраной клеток/органелл форме. Белок TWEAK способен стимулировать выработку провоспалительных цитокинов, контролирует процесс апоптоза, участвует в регуляции пролиферации и миграции клеток эндотелия сосудов тем самым выступая ангиогенным фактором [31]. На стадии развитого фиброза печени наблюдается переход акцента на ген cxcl12. Белок CXCL12 отвечает за хемотаксис, миграцию клеток и их адгезия, пролиферацию и др. процессы [32]. В точке перехода фиброза в цирроз наблюдается максимальная взаимосвязь между уровнем мРНК всех генов-мишеней. На стадии цирроза практически все связи ослабевают или разрываются. Выявленные в настоящем исследовании корреляционные связи между генами-мишенями могут свидетельствовать о их роли в процессе перехода фиброза в цирроз. Совместное относительно друг друга изучение генов является необходимым дополнительным параметром при проведении доклинических и фундаментальных исследований.

Заключение

На основании полученных результатов можно установить точку перехода фиброза в цирроз как самостоятельный отдельный этап фиброгенеза. В рамках настоящих исследований переход был зафиксирован на стадии F5, а сам процесс – с F4/F5 по F6. Данный этап имеет особые морфологические и молекулярно-генетические особенности, которые расширяют знания о патоморфологических изменениях печени и представляют фундаментальный и клинический интерес.

 

 

About the authors

Elena Ivanovna Lebedeva

Vitebsk State Order of Peoples’ Friendship Medical University

Author for correspondence.
Email: lebedeva.ya-elenale2013@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1309-4248
SPIN-code: 4049-3213

Associate Professor of the Department of Histology, Cytology and Embryology

Belarus, Republic of Belarus, 210009, Vitebsk, Frunze Ave 27,

Anatoly Tadeushevich Shchastniy

Vitebsk State Order of Peoples’ Friendship Medical University

Email: rectorvsmu@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2796-4240
SPIN-code: 3289-6156

professor, Head of the Chair of Hospital Surgery with the course of the Faculty
for Advanced Training & Retraining

Belarus, Republic of Belarus, 210009, Vitebsk, Frunze Ave 27

Andrei Sergeyevich Babenka

Belarussian State Medical University

Email: labmdbt@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5513-970X
SPIN-code: 9715-4070

Associate Professor of the Department of Bioorganic chemistry

Belarus, Republic of Belarus, 220116, Мinsk, Dzerzhinsky Ave., 83, building 15

References

Supplementary files

There are no supplementary files to display.