Pulmonary fibrosis: risk factors, pathogenesis and in vivo/in vitro experimental modeling

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Лёгочный фиброз (ЛФ) представляет собой гетерогенную группу патологических состояний, характеризующихся необратимым ремоделированием фиброзной (рубцовой) лёгочной интерстициальной ткани, что сопровождается нарушением дыхательной функции [1]. Фиброз лёгких является признаком многих болезней лёгких различной этиологии, в том числе хронической обструктивной болезни, астмы, кистозного фиброза и бронхолёгочной дисплазии. Фиброзные изменения также могут сопровождать заболевания интерстициальной ткани: гранулематозные заболевания (саркоидоз), а также пневмокониозы (асбестоз, силикоз, бериллиоз).

Лёгочный фиброз характеризуется низкой степенью выживаемости — 3–5 лет с момента постановки диагноза. Согласно предварительным расчётным данным, полученным на основе результатов опроса в крупных пульмонологических центрах Российской Федерации, распространённость ЛФ составляет около 9−11 случаев на 100 000 населения. Заболеваемость ЛФ в других странах — 4−6 случаев на 100 000 населения [2]. Помимо этого, текущая пандемия COVID-19 также, согласно оценке Всемирной организации здравоохранения, приведёт к резкому росту заболеваемости ЛФ.

На сегодняшний момент единственным методом лечения фиброза является операция по пересадке лёгких, однако её применение в значительной степени ограничено из-за крайней нехватки донорских органов, а также серьёзных побочных эффектов, связанных с иммунным отторжением пересаженных тканей. В качестве потенциальной замены трансплантации можно рассматривать методы регенеративной терапии, основанные на использовании стволовых клеток (локальные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки — иПСК) [3]. В настоящем обзоре показаны факторы риска возникновения ЛФ, клеточные механизмы его развития, а также основные модели in vitro и in vivo для изучения данной группы заболеваний лёгких.

ФАКТОРЫ РИСКА РАЗВИТИЯ ФИБРОЗА

Роль курения в развитии фиброза лёгких

Среди факторов риска ЛФ курение сигарет, по-видимому, является наиболее важной причиной для развития как спорадической, так и семейной формы ЛФ [4]. Сигаретный дым содержит твёрдые частицы, а также многочисленные химические вещества, в том числе высокотоксичные реактивные формы O^2– и N [5]. Механизм действия частиц включает нарушение работы антиоксидантной системы, баланса протеаз/антипротеаз в лёгочной ткани, а также способствует клеточному апоптозу и некрозу, что усугубляет воспаление [6]. У мышей, подвергнутых воздействию сигаретного дыма при пассивном вдыхании, наблюдается лёгочная нейтрофилия после острого (менее 5 дней) или хронического (несколько недель) воздействия [7]. Патология, наблюдаемая на модели с острым течением болезни, разрешается спонтанно, напротив, у хронической модели, как правило, наблюдаются признаки разрушения лёгких, альвеолярного коллапса и нарушения протеазного баланса.

Генетические мутации

Большая роль в развитии ЛФ отводится генетическим мутациям. Наиболее часто встречающаяся мутация, обусловливающая развитие данного патологического состояния, — полиморфизм промотора гена MUC5B (35% пациентов с ЛФ) [8]. Более того, мутации данного участка являются специфичными для ЛФ [8]. Возможный механизм заключается в том, что чрезмерная экспрессия MUC5B обусловливает хроническое усиление секреции слизи и её накопление в периферийном воздушном пространстве, что в свою очередь нарушает мукоцилиарный клиренс, приводит к слипанию слизи в бронхоальвеолярной области и создаёт условия для развития микроорганизмов, вызывая хроническое воспаление [9].

Лёгочный сурфактант (surfactant protein C, SP-C) — липопротеиновый комплекс, поддерживающий альвеолярный гомеостаз, который необходим для нормального функционирования лёгких. В альвеолах SP-C усиливает поверхностную активность и врождённый иммунитет лёгочной ткани. Разнообразие мутаций в гене SP-C (SFTPC) было идентифицировано у лиц с различными формами интерстициальных пневмонии и фиброза (более 40 мутаций) [10]. Фенотип болезни, обусловленной мутациями SFTPC, в 45% случаях наследуется как болезнь аутосомно-доминантного типа c неполной пенетрантностью или возникает как спонтанное заболевание, опосредованное мутацией de novo на p.Ile73Thr (в 55% случаях). У 10–15% больных респираторные симптомы развиваются в первый месяц жизни, у 40% — в период от 1 до 6 мес [11].

Развитие ЛФ также может быть опосредовано множественными мутациями в генах теломер: TERT (telomerase reverse transcriptase), кодирующий каталитический компонент теломеразы, и TERC (telomerase RNA component) — основной РНК-компонент теломеразы. Обе гетерозиготные мутации свидетельствуют об укорочении теломер, а также о повышенной предрасположенности к развитию ЛФ. В отличие от мутаций в гене SFTPC, в случае мутаций генов TERC и ТERT респираторные симптомы развиваются в возрасте 58–68 лет [12].

Среди прочих модификаций генов, оказывающих влияние на возникновение спорадических случаев ЛФ, отмечают полиморфизмы генов, кодирующих цитокины, такие как интерлейкин (IL)-1α, фактор некроза опухоли-α, лимфотоксин α, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 [13].

Роль вирусных инфекций в развитии лёгочного фиброза

Вирусная инфекция способствует повреждению эпителия лёгких, приводя к развитию ЛФ. Вирус Эпштейна–Барр обнаруживается в лёгочной ткани почти половины пациентов с этой патологией [14]. Предполагается, что при инфицировании данным вирусом происходит эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) клеток, вызванный экспрессией трансформирующего фактора роста β (TGF-β) и активацией сигнальных путей CUX1/Wnt [14]. Отмечается участие в развитии ЛФ цитомегаловируса, герпесвируса человека 7- и 8-го типов (вируса герпеса, ассоциированного с саркомой), бокавируса [15]. Так, по данным исследования [1], герпесвирусная инфекция обнаружена в лёгких у 15 из 23 человек, страдающих ЛФ.

Основной путь проникновения вируса SARS-CoV-2 предполагает связывание с рецепторами ангиотензинпревращающего фермента 2, присутствующими в большом количестве в лёгочной ткани. Это связывание приводит к активации экспресcии факторов роста, таких как TGF-β1, фактора роста соединительной ткани (CTGF), фибронектина 1 [16]. В результате взаимодействия вируса SARS-CoV-2 с пневмоцитами повышаются уровень ангиотензина 2, выработка провоспалительных цитокинов (IL-6, -8), активных форм кислорода (АФК) и активированного TGF-β1, способствующих пролиферации, миграции и дифференцировке фибробластов в миофибробласты [17].

Радиационно-индуцированный фиброз лёгких

Лучевая терапия является одним из методов лечения множественных злокачественных новообразований грудной клетки. Это также стандартный метод лечения пациентов с немелкоклеточным раком лёгкого. Однако эффективность лучевой терапии весьма ограничена из-за побочных эффектов, в частности радиационно-зависимых поражений лёгких (пневмонит, ателектазы и фиброз лёгких). Передача сигналов TGF-β/Smad способствует многим процессам радиационно-ассоциированного ЛФ, таким как образование АФК, активация миофибробластов, фиброцитов и синтез компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ). Поток частиц ионизирующего излучения взаимодействует с молекулами воды в биологических системах с образованием различных АФК, которые способствуют повреждению и гибели клеток [18]. После облучения повышенная продукция АФК связана с запуском молекулярного каскада, приводящего к перекисному окислению липидов, активации провоспалительных факторов и сигнального пути MEK/ERK [19]. В работе [20] показано, что важную роль в развитии радиационного фиброза играет формирование ателектазов при разрушении пневмоцитов.

ПАТОГЕНЕЗ ФИБРОЗА

Репаративная регенерация лёгкого происходит за счёт гипертрофии оставшихся частей и вовлечения структурных компонентов (альвеол, бронхиального дерева) [21]. Процесс восстановления лёгочной ткани состоит из четырёх различных, но связанных между собой этапов: свёртывания/коагуляции, фазы воспаления, рекрутирования/пролиферации фибробластов и ремоделирования ткани [22]. Первая стадия регенерации наступает сразу после повреждения лёгочной ткани и характеризуется продукцией цитокинов клетками, что приводит к формированию временного матрикса, состоящего из фибрина и фибронектина [23]. Следующая фаза воспаления характеризуется рекрутированием иммунных клеток [24]. На третьей стадии фибробласты дифференцируются в миофибробласты, которые продуцируют ВКМ, в частности коллаген I типа [25]. На последнем этапе миофибробласты, эпителиальные и эндотелиальные клетки повреждаются меньше [26]. Остальные миофибробласты подвергаются апоптозу.

Лёгочный фиброз является следствием фиброзирующего альвеолита, развивающегося по пневмонитогенному механизму [26]. Фиброзный альвеолит — основной морфологический признак интерстициальных заболеваний, он характеризуется очаговым (гранулёмы) или диффузным, острым или негнойным воспалением с исходом в фиброз. Центральную роль в формировании фиброза играют массовые скопления миофибробластов в паренхиме, а также избыточное отложение ВКМ [27]. Происхождение фибробластов при фиброзе лёгких — предмет многочисленных исследований [28–31]. Потенциальными источниками миофибробластов служат пролиферирующие резидентные стромальные клетки, дифференцированные производные мезенхимальных стромальных клеток костного мозга или ЭМП [32]. Фиброциты — это циркулирующие предшественники мезенхимальных клеток костного мозга, которые способны дифференцироваться в фибробласты и миофибробласты при попадании в ткань [28]. Фиброциты экспрессируют множество мезенхимальных маркёров, включая коллаген I типа, виментин, а также маркёр лейкоцитов CD45 и маркёр гемопоэтических стволовых клеток CD34 [33]. Кроме перечисленных молекул фиброциты экспрессируют хемокиновые рецепторы CCR2, CCR7 и CXCR4, которые регулируют их вход в очаги повреждения [34]. Показано, что с помощью трансформирующего профибротического цитокина TGF-β в фиброцитах можно индуцировать экспрессию α-гладкомышечного актина (α-SMA) [35]. Результаты исследований по трансплантации трансгенного костного мозга, меченного флуоресцирующим белком GFP, показали, что наибольший процент клеток, синтезирующих коллаген I типа при фиброзе лёгкого, приходится на популяцию фиброцитов трансплантированного костного мозга [30]. Однако часть исследователей отмечают минимальный вклад фиброцитов в продукцию α-SMA при трансплантации костного мозга в некоторых моделях [33].

Другой возможный патологический источник фибробластов — это ЭМП, физиологический и часто обратимый процесс, необходимый для нормального эмбрионального развития (но в некоторых случаях он возникает в процессе ответной реакции на повреждение) [36]. ЭМП определяется утратой клетками белков, способствующих формированию клеточного контакта (E-кадгерин), цитоскелетных (цитокератины) и люминальных белков, секретируемых клетками (поверхностно-активный белок С) [31]. ЭМП регулируется множеством внеклеточных лигандов, таких как TGF-β, эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), IL-1, CTGF, ядерный фактор-kB (NF-kB), и белками Wnt, которые инициируют внутриклеточные сигнальные каскады после связывания с поверхностными рецепторами [37].

Таким образом, дифференцировка фиброцитов, ЭМП и активация резидентных фибробластов лёгких могут способствовать развитию фиброза лёгких, но точная роль каждого из данных процессов в развитии патологии остаётся неясной. Понимание этих процессов и их вклада в развитие конкретных форм фиброза играет важную роль в рамках разработки потенциальной терапии.

МОДЕЛИ ЛЁГОЧНОГО ФИБРОЗА IN VIVO

Блеомициновая модель

Модель фиброза лёгких, опосредованная воздействием блеомицина, наиболее часто применяется в качестве экспериментальной для изучения фибротических процессов. Блеомицин представляет собой антибиотик, выделенный из Streptomyces verticillatus, который был идентифицирован как профиброзный агент [38]. Для воспроизведения экспериментальной модели фиброза блеомицин вводят несколькими способами, включая интратрахеальный, внутрибрюшинный, подкожный, внутривенный и ингаляционный. Интратрахеальный путь введения наиболее распространён [39, 40]. При интратрахеальном введении блеомицин вызывает воспалительные и фиброзные реакции в течение короткого периода времени (~1–2 нед). Гиперпродукция АФК за счёт хелатирования ионов металлов и реакции образовавшегося псевдофермента приводит к гибели эпителиальных клеток на 1–3-е сутки. Воспалительная реакция характеризуется повышением уровня провоспалительных цитокинов, в том числе IL-1, фактора некроза опухоли (TNF-α), IL-6 и интерферона-γ, а также образованием избыточных воспалительных инфильтратов (3–9-й день). Содержание профибротических маркёров, таких как TGF-β1, фибронектин и проколлаген-1, которые обеспечивают активацию фибробластов, отложение ВКМ и развитие фиброза, повышается к 9–10-му дню [40]. Фиброз можно визуализировать гистологически к 14-му дню, при этом максимальный ответ на введение БЛМ отмечается на 21–28-й день [40].

В работе [40] для моделирования фиброза блеомицин вводили интратрахеально (0,04 ЕД) раз в две недели в течение 4 мес молодым мышам. Авторы показали, что в ответ на повторное введение блеомицина у мышей наблюдались гиперплазия клеток Клара и клеток кубовидного альвеолярного эпителия, инфильтрация периальвеолярных протоков воспалительными клетками, увеличение альвеол и обширный фиброз [41]. В случае ЛФ было показано, что ранние молекулярные изменения в лёгких мышей при введении блеомицина наиболее сходны с таковыми при ускоренной острой фазе ЛФ у человека [42]. Однако фиброзные изменения, вызванные блеомицином, часто начинают разрешаться через 21–28 дней, и для воспроизведения хронических фиброзных изменений необходимо введение повторных доз [40].

Одной из наиболее широко используемых экспериментальных моделей изучения ЛФ, вызванного блеомицином, служат молодые мыши-самцы в возрасте 8–12 нед [42]. Однако было показано, что у молодых мышей происходит спонтанное разрешение фиброзных изменений, вызванных блеомицином, — явление, которое не наблюдается у старых мышей [43], что имеет клиническое значение при исследовании ЛФ у пожилых людей.

Воздействие кремнезёма и силикатов (асбестоз)

Непрофессиональное воздействие кристаллического кремнезёма возникает в результате использования многих коммерческих продуктов, таких как чистящие средства, наполнитель для туалета домашних животных, герметики, косметика, глина и краски [44]. Введение диоксида кремния в лёгкие грызунов приводит к развитию фиброзных узелков, которые напоминают поражения, развивающиеся у человека при воздействии минеральной пыли и аэрозолей. При моделировании силикоза используется кристаллический кремнезём, и развитие фиброза в этой модели происходит в течение 2 мес. Введение частиц кремнезёма может осуществляться разными путями, включая аэрозольный, интратрахеальный или оротрахеальный [38]. В работе [45] показано, что запуск фиброзного ответа происходит за счёт стимуляции эпителиальных клеток и макрофагов после воздействия кремнезёма, что приводит к повышению содержания воспалительных цитокинов и других медиаторов, включая фактор роста тромбоцитов (PDGF), TGF-β, TNF-α и IL-10. Чрезмерный окислительный стресс, вызванный вдыхаемыми частицами, перегружает механизмы антиоксидантной защиты, что может привести к развитию ЛФ [45].

Основным преимуществом силикатной интратрахеальной модели является замедленный клиренс частиц кремнезёма, что приводит к стойкой фиброзной реакции. ЛФ, вызванный частицами кремнезёма, может осложняться мутацией промотора гена MUC5B, связанной со снижением клиренса [46]. У некоторых больных, предрасположенных к развитию ЛФ, отмечается изменение длины теломер в генах [47].

Асбест-индуцированная модель фиброза может быть чётко идентифицирована по нескольким гистологическим признакам, включая асбестовые тельца, несколько очагов миофибробластов и фиброз бронхиолярной стенки [48].

Изотиоцианат флуоресцеина

Лёгочный фиброз, индуцированный изотиоцианатом флуоресцеина (fluorescein isothiocyanate, FITC) схож с блеомицин-опосредованным фиброзом в том смысле, что в обеих моделях воспаление предшествует образованию фиброза [39]. Центральную роль в рекрутировании фиброцитов при прогрессировании FITC-индуцированного фиброза играет взаимосвязь между IL-13, CCR2 и лигандом CCL12 [49]. Недостатки FITC-модели включают отсутствие характерных признаков интерстициальной пневмонии и преобладание инфильтратов мононуклеарных клеток до фиброза [50].

Трансгенные модели

Для доставки плазмидной ДНК в ядра клеток при исследовании фиброза широко используют наночастицы, клеточные органеллы (липосомы), вирусные векторы (аденовирусные или лентивирусные) [51]. Основная масса таких подходов сводится к активации/подавлению экспрессии различных факторов, таких как TGF-β, TNF-α, IL-1β, IL-13, SMAD7 [51, 52]. Чрезмерная экспрессия TGF-β может быть индуцирована введением аденовирусного вектора или доксициклином в эпителиальные клетки (клетки Клара). При добавлении доксициклина в воду для питья экспериментальным животным происходят стимуляция экспрессии TGF-β после 12 ч обработки доксициклином и запуск фиброзного ответа в эпителиальных клетках [53]. Фибротические изменения в течение периода воздействия доксициклина сохраняются до 2 мес [53]. Такая кинетика наблюдается и при интраназальной аденовирусной доставке TGF-β, приводящей к апоптозу эпителиальных клеток, мононуклеарной инфильтрации и фиброзному рубцеванию [52].

Аденовирусный перенос также применяется для экспрессии IL-1β, TNF-α, IL-13, приводящей к ранней воспалительной реакции и отложению коллагена за счёт активации сигнального пути TGF-β [54]. В исследовании [55] показано, что блеомицин-индуцированный фиброз может быть частично подавлен усилением экспрессии SMAD7, который блокирует образование комплексов SMAD2/SMAD4 и таким образом подавляет передачу сигналов TGF-β. Интересно, что ремоделирование сосудов также влияет на развитие фиброза. Было показано, что увеличение экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), стимулирующего ангиогенез, усугубляет фиброз у грызунов, трансгенных по TGF-β1 [56]. Однако при внутривенном введении аденовирусных частиц, кодирующих антиангиогенный белок вазогибин 1 (VASH1), наблюдается угнетение фиброгенеза [57].

Важно отметить, что не все описанные экспериментальные модели хорошо отработаны и изучены и поэтому они могут использоваться только для анализа определённых патологических путей, без экстраполяции на весь клеточный патогенез ЛФ человека.

МОДЕЛИ ЛЁГОЧНОГО ФИБРОЗА IN VITRO

2D-модели культуры

Существует множество in vitro моделей изучения ЛФ, начиная от 2D-монокультур/ко-культур и заканчивая самоорганизующимися 3D-сфероидами и органоидами. Наиболее распространённая экспериментальная модель in vitro основана на двухмерном (2D) культивировании клеток на различных подложках (пластик, стекло). Двухмерная клеточная культура является одной из самых простых и надёжных моделей, используемых для изучения основных механизмов фиброза, а также тестирования про- и антифиброзных лекарственных соединений. 2D-платформы обладают рядом преимуществ, таких как простота использования, высокая продуктивность, клеточные визуализация и профилирование в различных условиях [58].

Основное преимущество использования 2D-культур — лёгкость выращивания клеток для последующей оценки экспрессии профибротических генов после обработки различными веществами. Показано [59], что первичные фибробласты после обработки TGF-β при последующем культивировании трансформируются в высокопролиферативные, ВКМ-синтезирующие миофиброциты, напоминающие их соответствующие клеточные аналоги in vivo.

Основной недостаток 2D-культуральных платформ — невозможность воспроизведения патофизиологического фиброза тканей. Продемонстрировано, что повышение жёсткости ВКМ увеличивает активацию TGF-β1 за счёт контракции миофибробластов [60]. Другим серьёзным ограничением 2D-моделей является их неспособность имитировать фиброзную микросреду, что приводит к физиологически неадекватному поведению клеток. Фиброзные области характеризуются чрезмерным отложением коллагена и имеют более высокую жёсткость (20–100 кПа) по сравнению с нормальной паренхимой легких (1–15 кПа).

2.5D-модели культуры

Наиболее распространёнными 2.5D-моделями являются системы, включающие использование ВКМ, Transwell-системы и «сэндвич»-модели [61–64], которые обеспечивают клеточную адгезию, подобно 3D-моделям, и формирование трёхмерных эпителиальных ацинарных структур. Transwell-системы представляют собой монослойные культуры, способствующие адгезии клеток на мембрану, которая обеспечивает моделирование сложных процессов на уровне органов/тканей, включая трансмиграцию лейкоцитов. Transwell-системы в основном используют для со-культивирования клеток лёгких, где эпителиальные культуры часто взаимодействуют с эндотелиоцитами лёгочных капилляров и/или фибробластами. Совместное культивирование клеток аденокарциномы (линия A549) с нормальными или патологическими ЛФ-фибробластами в Transwell-системе при моделировании процесса заживления ран показало снижение миграции фибробластов, связанных с ЛФ, по сравнению с нормальными фибробластами. Такое снижение было обусловлено патологической активацией сигнального пути в ЛФ-фибробластах, связанного с PDGF [64].

В норме эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки поляризованы и прикреплены к базальной мембране. Matrigel — это растворимая основа базальной мембраны, извлечённая из саркомы грызунов, богатая ламинином, коллагеном IV, протеогликанами и рядом факторов роста [65]. В работе показано [65], что альвеолярные эпителиальные клетки II типа, культивируемые на Matrigel, способны к формированию кист, выстланных поляризованным монослоем клеток, которые продуцируют сурфактант.

Метод «сэндвич»-культуры in vitro основан на культивировании фибробластов, эпителиальных, эндотелиальных клеток, расположенных между двумя слоями различных механически перестраиваемых подложек (например, полиакриламида) [61, 63]. Данная экспериментальная модель применятся при исследовании клеточной механобиологии, в основном фибробластов, обеспечивая клеточную адгезию во всех трёх плоскостях (Х, Y, Z) [66]. Также «сэндвич»-культура позволяет имитировать условия, которые наблюдаются в фиброзных очагах, где фибробласты растут между субстратами различной жёсткости (нормальная и фиброзная лёгочная ткань).

3D-модели культуры

Трёхмерные (3D) модели обеспечивают миграцию, хемотаксис и межклеточное взаимодействие во всех трёх плоскостях, аналогично условиям in vivo. При 3D-моделировании ЛФ используют эпителиальные, эндотелиальные, иммунные клетки, иПСК и фибробласты.

Гидрогелевые системы. Гидрогели, изготовленные из природных субстратов, таких как коллаген I типа, фибрин и гиалуроновая кислота, являются наиболее изученными 3D-системами для моделирования ЛФ, поскольку коллаген I типа и гиалуроновая кислота — основные компоненты фиброзных очагов и рубцов [61]. P.D. Arora и соавт. [67] изучили фибробласт-опосредованную контракцию коллагена при действии TGF-β1 и показали, что степень податливости коллагенового геля напрямую связана с уровнем экспрессии α-SMA и α1-, β1-интегринов фибробластами. Податливые коллагеновые гели по сравнению с гелями, имеющими среднюю и высокую степень жёсткости, демонстрировали сниженную экспрессию α-SMA и интегринов культивируемыми фибробластами. Существенным ограничением широкого использования природных гидрогелей является неспособность настроить механические свойства для моделирования жёсткости, типичной для фиброзной ткани, и обеспечить пролонгированное культивирование in vitro из-за деградации гидрогелей. Наиболее часто используемые синтетические гидрогели для изучения биологии фибробластов изготавливаются из полиакриламида (ПА) и полиэтиленгликоля (ПЭГ). ПА в основном используются в качестве механически перестраиваемых 2D-субстратов. Гидрогель ПЭГ обеспечивает формирование 3D-культуры клеток и может быть использован для моделирования заболеваний, сопровождающихся фиброзом [61].

Бесклеточные матрицы. Бесклеточные матрицы, полученные из ткани или органа при обработке веществами-детергентами, такими как 3-[(3-холамидопропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфонат, в основном используют для исследований матрикс-ассоциированных клеточных взаимодействий при фиброзе, так как они сохраняют трёхмерную структуру и белковую композицию ВКМ. Практическая цель удаления клеток из органов/тканей — это имплантация донорской ткани, засеянной клетками реципиента. Бесклеточная лёгочная ткань служит многообещающей моделью для исследования ЛФ в условиях in vitro, поскольку она имитирует состав, структуру и жёсткость ВКМ лёгких в норме [68]. Интересно, что фибробласты, посеянные в матрицах ЛФ-производных, дифференцируются в миофибробласты. Экспрессия профибротических генов в фибробластах является результатом индукции со стороны ВКМ [69].

Срезы ткани лёгких. Срезы ткани лёгких (СТЛ) изготавливают путём разрезания свежей ткани, полученной в результате хирургических резекций, на кусочки толщиной 200–250 мкм [69]. Наиболее важные преимущества СТЛ — высокая пропускная способность и степень сходства с микросредой лёгких in vivo, что предполагает их использование в качестве доклинических моделей для тестирования лекарственных препаратов. При обработке СТЛ лёгких человека и мыши различными концентрациями пирфенидона и нинтеданиба (1,0 мкм и 2,5 ммоль) в присутствии/отсутствии TGF-β происходило ингибирование профибротического действия цитокина (усиление экспрессии α-SMA) в обеих системах [70]. Основным недостатком СТЛ является то, что подготовка кусочка приводит к формированию двух поверхностей, которые вызывают регенеративную реакцию [71]. Кроме того, жизнеспособность кусочков сохраняется в течение лишь 7 дней, что также служит одним из ограничивающих факторов использования СТЛ.

Лёгочные сфероиды и органоиды. Сфероиды — это клеточные агрегаты, состоящие из дифференцированных (зрелых) клеток или стволовых клеток, которые культивируются на планшетах с низкой адгезией, в системах «висячая капля», в суспензии или микротитрационных планшетах [72–74]. Лёгочные органоиды — это более сложные самоорганизующиеся структуры, состоящие из специфичных для лёгких клеток (созданных на основе иПСК), которые следуют последовательным этапам развития тканей, схожим с таковыми in vivo [75]. В отличие от сфероидов, органоиды, как правило, лучше воспроизводят тканевую организацию с физиологически нормальным распределением различных типов клеток. Однако in vitro культивируемые органоиды лёгких не способны к формированию альвеолярной структуры и микроваскулярному созреванию, что служит значительным ограничивающим фактором. При инкубации с TGF-β1 самосборные органоиды, населённые эмбриональными фибробластами лёгких, демонстрируют признаки тканевого рубцевания (усиление продукции α-SMA и коллагена I типа), сходного с ЛФ [76]. Кроме того, показано [77], что лёгочные сфероиды, содержащие базальные клетки и культивируемые на Matrigel, могут образовывать аквапорин-положительные альвеолярные структуры, что указывает на дифференцировку стволовых клеток в составе сфероида. Органоиды, созданные на основе иПСК, также обеспечивают уникальную платформу для скрининга лекарств, токсикологических исследований и генной терапии [74]. Однако использование иПСК-органоидов весьма ограничено вследствие трудоёмких процессов, связанных с получением и культивированием клеток. Преимущество сфероид- и органоид-систем по сравнению с двумерными моделями прежде всего обусловлено возможностью моделирования клеточного и ВКМ-опосредованного взаимодействия, что наблюдается в условиях in vivo.

Основное ограничение использования 3D-моделей ЛФ — сложность и изменчивость размера/формы экспериментальных систем, что затрудняет получение статистически значимых результатов.

Фиброз-на-чипе. Хотя органоиды или сфероиды обладают большим потенциалом, значительными недостатками этих систем можно назвать невозможность воспроизведения «текучести» микросреды и активной механической стимуляции. «Лёгкие-на-чипе» представляют собой 3D-системы, содержащие монослои эпителиальных/эндотелиальных клеток и воспроизводящие уникальные особенности альвеолярной микросреды, включая дыхательные движения, аэрогематический барьер, газообмен [78]. Система «фиброз-на-чипе» создана путём интеграции фибробластов в коллагеновый гидрогель внутри устройства искусственного кровообращения. 3D-биоинженерная лёгочная фиброзная ткань была разработана с использованием коллагеновых гидрогелей, засеянных эпителиальными и эндотелиальными клетками дыхательных путей, в сочетании с биореакторной системой Flexcell [58]. Несмотря на эти ограничения, технология «фиброза-на-чипе» предоставляет исследователям платформу для моделирования реакций и тестирования лекарственных препаратов на уровне органов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

За последние годы был достигнут значительный прогресс в понимании механизмов развития лёгочного фиброза. Животные модели до сих пор остаются основными доклиническими in vivo системами для тестирования лекарственных антифибротических препаратов. Однако ввиду того, что многие исследования, проводимые на этих моделях, зачастую терпят неудачу при клинических исследованиях на людях, существует определённая потребность в усовершенствовании адаптированных для человека моделей in vitro, используемых для тестирования лекарственных препаратов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Научное исследование выполнено при поддержке гранта НШ-4664.2022.1.4.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. И.В. Чистякова — обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, подготовка и написание текста статьи; А.Б. Малашичева — курация, обзор литературы, редактирование статьи. Оба автора подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (оба автора внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This work was supported by the grant НШ-4664.2022.1.4.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors' contribution. I.V. Chistyakova — literature review, collection and analysis of literary sources, writing the text and editing the article; A.B. Malashicheva — curation, literature review, editing the article. Both authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (both authors have made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication).

About the authors

Irena V. Chistyakova

Institute of Cytology Russian Academy of Science

Author for correspondence.
Email: itjerena7@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7229-5766
SPIN-code: 3804-6426

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Saint Petersburg

Anna B. Malashicheva

Institute of Cytology Russian Academy of Science

Email: malashicheva@incras.ru
ORCID iD: 0000-0002-0820-2913
SPIN-code: 6053-2075

Dr. Sci. (Biol.), Associate Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files