Human fetal liver and spleen (Cell composition)

Full Text

Введение

Клетки эмбриональных и фетальных органов человека, как и клетки пуповинной крови, давно привлекают внимание исследователей и практиков как богатый источник гемопоэтических стволовых клеток [ГСК]. Большой интерес представляет эмбриональная печень [ЭП], уникальность которой заключается в том, что в период от 4 до 16 недель гестации в ней происходит активное кроветворение, и она в этот период содержит большое количество ГСК и их потомков. Низкая иммуногенность стволовых клеток ЭП делает их использование для нужд трансплантации еще более привлекательным [1-6].

Первые гемопоэтические клетки наблюдаются у 3-х-недельного зародыша человека в стенке желточного мешка. Недифференцированные клетки эмбриона - «мезобласты» - дифференцируются в первичные примитивные эмбриональные эритробласты с мегалобластическими чертами и в первичные эндотелиальные клетки, образующие сосудистую сеть желточного мешка. Несколько позже в желточном мешке из «мезобластов» возникают другие бластные клетки, дающие начало вторичным или окончательным эритробластам и эритроцитам [7, 8]. Здесь же, на 3-4 неделе развития, выявляются первые CD34⁺ клетки-предшественники гемопоэза.

Печень закладывается на 4 неделе гестации. Из желточного мешка в неё мигрируют ГСК, так что к 4-6 неделе в эмбриональной печени начинается гемопоэз, и она становится главным местом кроветворения, в то время как в желточном мешке гемопоэз редуцируется [9-12]. Это печеночный или гепато-лиенальный период кроветворения. Гемопоэз в селезенке начинается на 8-10 неделе эмбриогенеза и максимум её гемопоэтической активности приходится на 16-ю неделю развития [13, 14]. Печеночная ткань представлена гепатоцитами - производными энтодермы и кроветворными клетками - производными мезодермы. Первичные элементы крови в печени представляют собою полипотентные стволовые клетки [ПСК], которые дифференцируются в первичные эритробласты и недифференцированные бластные элементы - предшественники лейкоцитов и нормобластической ветви эритрона [15]. Преобладание эритропоэза в период печеночного кроветворения отмечают все исследователи, изучавшие гемопоэз в ЭП [6, 16, 17]. В то же время, уже на ранних стадиях развития эмбриона выявляются скопления цитохимически недифференцированных бластных клеток, окруженных первичными эритроидными элементами и клетками нормобластического эритропоэза [4, 17-21]. Довольно рано в ЭП появляются немногочисленные гранулоциты, моноциты, макрофаги.

Соотношение эритроидных и гранулоцитарных элементов равно 5:1 у 5-6-недельных зародышей и 2:1 у 24-недельных [22]. Более зрелые дефинитивные эритроидные клетки обнаруживаются в печени уже на 6-й неделе гестации, а к 21-й неделе примитивные эритроидные элементы уже почти полностью в ней отсутствуют [21]. Согласно М. Tavian, В-лимфоцитопоэз начинается в ЭП около 9-й недели гестации [8], но по данным других исследователей иммунофенотипический анализ не выявил фенотипически и функционально зрелых В- и Т-лимфоцитов в печени 9-10-недельных эмбрионов [23]. Лишь у 13-22-недельных плодов человека в клеточной суспензии печени были обнаружены Т-лимфоциты [23, 24]. Авторы делают вывод, что в печени эмбрионов первых трех месяцев жизни не содержатся клетки, способные вызвать реакцию «трансплантат против хозяина» [РТПХ] при трансплантации.

Клиническое применение криоконсервированных клеток человеческой ЭП является актуальным [6]. Деконсервированная суспензия клеток ЭП содержит большое количество гликофорин Аппозитивных эритроидных клеток - предшественников различныхуровней коммитирования и созревания. Содержание CD45⁺ клеток в печени плодов 6-12 недель гестации составляет более 2% [6, 23].

Изучение фенотипа и функциональной активности ГСК эмбриональной и фетальной печени показало, что этот орган во втором триместре является богатым источником CD34⁺ клеток [6, 25]. Содержание CD34⁺ и АС-133⁺ - гемопоэтических клеток - предшественников составляет, по некоторым данным, 0,9±О,1 и 0,4±0,1% соответственно [6]. При культивировании деконсервированных клеток ЭП в культуральной среде на основе метилцеллюлозы в присутствии ростовых факторов получено более 500 колоний - КОЕ-ГЭММ, БОЕ-Э, КОЕ-ГМ - на 1х10⁵ мононуклеаров [6]. Показано, что колониеобразующая способность [КОС] клеток ЭП 6-12-недельных эмбрионов значительно выше, чем таковая у клеток костного мозга взрослого человека и пуповинной крови [6, 26, 27]. На колониеобразующую способность клеток ЭП влияет возраст эмбрионов и плодов. Деконсервированные клеточные суспензии ЭП 6-9-недельных эмбрионов содержат в 3 раза большее количество КСЕ-ГЭММ, чем образцы печени 10-12-недельных зародышей [6], то есть с увеличением гестационного возраста КОС клеток печени снижается.

Согласно культуральным исследованиям, проведенным в нашем институте, пик пролиферативной активности стволовых клеток [СК] эмбриональной печени приходится на 9-10-ю неделю, а второй подъем на 21-ю неделю [26, 28].

Таким образом, криоконсервированные клетки ЭП содержат гемопоэтические СК, способные к мультилинейной дифференцировке in vitro. Из этого следует, что ГСК эмбриональной печени являются перспективным источником для трансплантации [2, 6, 29, 30].

Принимая во внимание перспективы использования клеток ЭП для трансплантации, мы изучали клеточный состав фетальной печени и селезенки человека [31]. Целью исследования было выявить наиболее активные периоды гемопоэза в печени и селезенке эмбриона и плода в различные сроки гестации.

Материал и методы

Органы получали от эмбрионов и плодов человека в возрасте 6-27 недель внутриутробного развития. Клеточный состав органов изучали в отпечатках на предметных стеклах; окрашивали по Май-Грюнвальду. Гепатограммы и спленограммы подсчитывали в световом микроскопе на 1000 клеток, результат выражали в процентах. Цифровые данные подвергали вариационно-статистической обработке по Стьюденту-Фишеру. Изучены 76 отпечатков эмбриональной и фетальной печени в период 6-27 недель развития. Образцы селезенки исследованы у 10 плодов в возрасте 19-25 недель.

Результаты и обсуждение

При изучении 76 отпечатков печени от 76 эмбрионов и плодов были выделены следующие возрастные группы: 6-7 недель [1 группа], 8-9 недель [2 группа], 10-11 недель [3 группа], 12-13 недель [4 группа], 17-21 неделя [5 группа], 22-27 недель [6 группа].

Из таблицы видно, что на всём протяжении исследуемых периодов в печени преобладает эритропоэз. Общее содержание клеток эритроидного ростка составляет более 80%.

Первичные эритроидные элементы демонстрируют все морфологические стадии созревания, присущие мегалобластам. Среди них были выделены следующие клетки:

1. Первичные проэритробласты - крупные бластные клетки с диаметром от 15 до 23 мкм с разреженной структурой ядерногохроматина, одним-двумя крупными нуклеолами, резко базофильной цитоплазмой.
2. Первичные базофильные эритробласты - клетки диаметром от 15 до 25 мкм, с «ажурным» ядром и базофильной цитоплазмой. Ядрышки очерчены нечетко.
3. Первичные полихроматофильные эритробласты - клетки диаметром от 15 до 27 мкм с полихроматофильной цитоплазмой. Ядрышки не определяются.
4. Первичные оксифильные эритробласты - клетки диаметром от18до 27 мкм, с небольшим плотным, часто эксцентрически расположенным ядром и оксифильной цитоплазмой. В отпечатках встречаются также мегалоциты - утратившие ядра первичные эритробласты.

Количество первичных эритробластов с увеличением срока развития плода постепенно уменьшается. Так, если в 6-7 недель первичные эритробласты составляют четвертую часть всех эритроидных клеток, то в период 22-27 недель их содержание не достигает и 1,5%. Различия статистически достоверны для первичных проэритробластов в группах 1-3 [р < 0,05]; 1-5, 1-6, 2-3, 2-5, 2-6, 3-5, 3-6, 4-5, 4-6 [р < 0,01]. Содержание первичных эритробластов также достоверно снижается вплоть до 17-21-й недели развития. Соответственно общее содержание нормобластических эритроидных элементов с возрастом плода увеличивается, хотя имеет место снижение содержания эритробластов [достоверны различия в группах 2-5, [р < 0,001] и базофильных нормобластов [достоверны различия в группах 1-5, [р < 0,01]; 1-6, [р < 0,001]; 2-6,2-7 [р < 0,001]; 3-5,3-6, [р < 0,01]; 4-5, 4-6, [р < 0,05]. В период от 17 и более недель эритроидное кроветворение в фетальной печени уже почти полностью нормобластическое. Кроме эритроидных элементов уже на ранних стадиях развития отмечены клетки нейтрофильного ряда.

Содержание нейтрофилов в рассматриваемых группах колеблется в пределах 1-1,5%. Наблюдается некоторая тенденция к увеличению содержания клетокнейтрофильного ряда с увеличением срока развития плода. Статистически достоверные различия получены для промиелоцитов в группах 1-2 [р < 0,05] и 2-5 [р < 0,05], для метамиелоцитов в группах 1-6 [р < 0,01] и 5-6 [р < 0,05], для палочкоядерных нейтрофилов в группах 1-4 [р < 0,05], 1- 5 [р < 0,05] и сегментоядерных нейтрофилов в группах 2-6 [р <0,05] и 4-6 [р < 0,05].

Подобная картина наблюдается и в отношении эозинофилов и базофилов, содержание которых повышается с увеличением возраста плода. Для эозинофилов статистически достоверные различия получены в группах 1-5 [р < 0,05], 1-6 [р < 0,01], 2-6 [р < 0,01], 3-6 [р < 0,01], 4-6 [р < 0,05].

Также имеет место увеличение содержания моноцитов для групп 1-5 [р < 0,05], 1-6 [р < 0,01], 2-6 [р < 0,01], 3-6 [р < 0,05], 4-6 [р<0,01].

Содержимое макрофагов и мегакариоцитов в период от 6 до 27 недель остается стабильным.

Наиболее выраженная динамика наблюдается в содержании лимфоцитов, которое увеличивается от 0 в период 6-7 недель до 10,0 ±1,5% в период 22-27 недель. Различия для всех групп, кроме 2-4 и 3-4, статистически достоверны [р < 0,01 и < 0,001]. По морфологическим признакам это малые лимфоциты диаметром 6-7мкм.

Таким образом, около 95% всех гемопоэтических клеток в фетальной печени - это дифференцирующиеся и зрелые элементы, подавляющую часть которых составляют клетки эритроидного ряда. Представляет интерес группа бластных клеток, названных нами недифференцированными. Их содержание колеблется от 2,9±0,5 до 5,1±1,01%. Различия статистически достоверны для групп 1-2 и 1-4. Наибольшее количество недифференцированных бластных клеток наблюдается в период 6-8 и 17-21 недель, что соответствует данным А.А. Ракова с соавт. [28], изучавших КОС гранулоцитомоноцитарных предшественников фетальной печени человека и показавших, что на 9-й и 21-й неделе в печени плода отмечается наиболее высокое содержание миелоидных предшественников.

В определенной степени можно судить о пролиферативном потенциале этих клеток на основании изучения КОС гемопоэтических клеток ЭП. При помощи таких экспериментов, проведенных в нашем институте [26], было установлено, что относительное содержание коммитированных стволовых клеток миелоидного ряда в эмбриональной печени в несколько раз выше, чем в костном мозге взрослого человека. Отсюда можно заключить, что ЭП в период до 27 недель - орган очень активного кроветворения.

Нами был изучен клеточный состав фетальной селезенки у 10 плодов в возрасте 19-25 недель. Небольшой материал не позволил нам провести исследования в различных возрастных группах. Клеточный состав фетальной селезенки плодов в возрасте от 19 до 25 недель внутриутробного развития уже довольно однороден - 85,0% всего клеточного состава приходится на лимфоидные клетки, среди которых 2,9±0,4% составляют лимфобласты, 4,7±0,7% пролимфоциты и 77,4±1,5% - лимфоциты. Содержание гранулоцитов невелико и не превышает 4,2%, из них 1,7±0,3% и 0,9±0,2% приходится, соответственно, на долю эозинофилов и базофилов. Эритроидные элементы составляют 9,4%. Содержание недифференцированных бластов составило 0,3% диаметром от 14,3±0,44 до 15,85±0,2мкм. Они характеризуются высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением, нежно-зернистой структурой ядерного хроматина, наличием 1-4 ядрышек. Цитоплазма от светло-голубой до базофильной, включений не содержит.

Изучение КОС миелоидных предшественников эмбриональной селезенки показало, что содержание СК в селезенке плода 18-21 недель развития значительно превышает их содержание в костном мозге взрослого человека [26].

Это дает основание рассматривать также и фетальную селезенку как возможный источник стволовых полипотентных клеток.

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют считать, что в фетальной печени и селезенке человека содержатся СК клетки, и эти органы могут рассматриваться как перспективные источники выделения ГСК в целях трансплантации.

About the authors

K. M. Abdulkadyrov

Scientific research institute of Hematology and Transfusiology

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, St.Petersburg

V. A. Balashova

Scientific research institute of Hematology and Transfusiology

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, St.Petersburg

References

Supplementary files