The role of the Nanog factor in the regulation of pluripotency and differentiation of embryonic stem cells

Full Text

Фактор Nanog является гомеодоменным протеином, экспрессирующимся в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК] и дифференцирующихся первичных половых клетках [1]. Делеция Nanog приводит к гибели эмбрионов [2], в то время как его конститутивная экспрессия обеспечивает самообновление популяции ЭСК и поддержание их плюрипотентного состояния как in vivo, так и in vitro [3, 4]. Прекращение экспрессии Nanog считается свидетельством начала дифференцировки ЭСК. При повышении уровня этого белка клетки дольше сохраняют способность к самообновлению и дольше остаются недифференцированными in vitro [5].

До настоящего времени подавляющее большинство исследований было связано с выявлением влияния Nanog на дифференцировку и самообновление клеток [6]. Мало известно о том, каким образом профиль экспрессии этого гена связан с процессами эмбрионального развития, как снижение или полное прекращение его экспрессии влияет на закладку зародышевых листков, и жизнеспособны ли Nanog-/- ЭСК. Исследователи из группы I. Chambers в своей работе, результаты которой были опубликованы в журнале Nature, провели несколько серий экспериментов с целью определения биологической роли этого фактора.

Первая серия экспериментов, проведенная in vitro на культурах ЭСК мыши, была направлена на определение характера экспрессии Nanog различными клетками в пределах одной популяции. Авторы произвели инсерцию гена зеленого флуоресцентного белка (eGFPJ в область AUG кодона гена Nanog, в результате чего экспрессия Nanog приводила к последующей экспрессии GFP. Было показано, что в культуре присутствовали как GFP^-, так и GFP⁺ клетки, однако авторы не указывают сроков, на которых производился анализ. При этом оба типа клеток экспрессировали маркеры ЭСК Oct4 и SSEA1. При разделении двух популяций с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) и их дальнейшем раздельном культивировании было показано, что практически 100% GFP⁺ клеток могут давать начало ОРР^_-популяциям, но при этом, что особенно интересно, может происходить и обратный процесс, то есть в клетках может происходить реактивация гена Nanog.

Предыдущие исследования предполагали, что индуцированная остановка экспрессии гена Nanog должна приводить к дифференцировке ЭСК [2]. Для проверки этой гипотезы авторы использовали линию трансгенных ЭСК, в которых экспрессия Nanog подавлялась тамоксифеном. Однако при этом не происходило мгновенной активизации процессов дифференцировки клеток. Отдельные дифференцированные клетки появлялись только на 5-7 сутки после обработки клеточной культуры тамоксифеном. Подавление экспрессии Nanog никак не сказывалось на экспрессии протеинов Sох2 и Oct4, а также так называемых транскриптов, ассоциированных с эмбриональными стволовыми клетками, (embryonic stem-cell associated transcripts, ECATs).

При этом клоногенный потенциал Nanog-/- ЭСК отличался от клоногенного потенциала Nanog+/+3CK. Nanog-/- клетки формировали гораздо меньшее число колоний, в которых при этом наблюдалось понижение уровня щелочной фосфатазы. Тем не менее, часть колоний характеризовалась повышенной экспрессией этого фермента, и формирование таких колоний зависело от присутствия экзогенного фактора LIF (leukaemia inhibitory factor). Это служит доказательством того, что плюрипотентность Nanog-/- клеток не вызвана эпигенетическими факторами, так как клетки, вторично индуцированные к плюрипотентности, не способны реагировать на стимуляцию LIF (т.н. эпиЭСК) [7].

Для определения способности Nanog-/- ЭСК к дифференцировке авторы провели трансплантацию этих клеток под капсулу почки иммунодефицитным мышам. Было показано, что Nanog-/-3CK формируют «тератомы», в которых присутствуют производные трех зародышевых листков.

Таким образом, делеция фактора Nanog не приводит к утрате самообновления, клоногенности и плюрипотентности у ЭСК. Они также способны de novo включаться в развивающийся эмбрион, что было показано с помощью создания химерных морул из Nanog-/- и Nanog+/+ клеток. Впоследствии происходило внедрение GFP Nanog-/- клеток в нейроэпителий и ткани печени и мышц взрослых животных. То есть делеция Nanog не влияет и на способность ЭСК давать начало терминально дифференцированным клеткам взрослого организма, что противоречит литературным данным [2].

Однако было показано, что экзогенное подавление экспрессии Nanog приводит к запрету дифференцировки ЭСК в первичные половые клетки. При реактивации Nanog в таких клетках методом гомологичной рекомбинации происходило полное восстановление их потенциала к дифференцировке.

Таким образом, нельзя сказать, что эта работа опровергает данные более ранних исследований. Тем не менее, ее результаты указывают на ошибочность предположений о том, что функционирование Nanog неотделимо от двух других ключевых факторов ЭСК - Sох2 и Oct4 [8]. Действительно, Nanog-/- ЭСК обладают сниженным в сравнении с клетками дикого типа клоногенным потенциалом и в большей степени склонны дифференцироваться в энтодермальном направлении, хотя образуют производные и других зародышевых листков.

Прекращение экспрессии Nanog не служит необходимым и достаточным сигналом к началу дифференцировки клеток. По-видимому, флуктуации его экспрессии регулируют дифференцировочный потенциал клеток, все больше ограничивая его при повышении внутриклеточной концентрации протеина. Зависимость способности к самообновлению популяции от Nanog носит, по предположению авторов, сходный характер. Этим можно объяснить различные степени коммитации ЭСК к дифференцировке в пределах популяции. Повышение экспрессии Nanog также может вернуть уже коммитированные к дифференцировке ЭСК в плюрипотентное состояние [1].

Важно отметить, что в процессе эмбрионального развития Nanog не экспрессируется конститутивно на одном и том же уровне в плюрипотентных клетках эмбриона. Он экспрессируется в клетках бластоцисты, затем уровень его экспрессии падает во время имплантации [1], после чего вновь начинает возрастать в области эпибласта, клетки которого дольше сохраняют характеристики ЭСК [9]. Таким образом, данные работы во многом объясняют функции фактора Nanog, играющего одну из основных ролей в таких процессах, как закладка внутренней клеточной массы бластоцисты и впоследствии зародышевых листков, регуляция плюрипотентности и самоподдержания популяций ЭСК, а также процесс эпигенетического репрограммирования дифференцированных клеток организма в «стволовые», которому уделяется много внимания в современных исследованиях [10].

About the authors

A. S. Grigoryan

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files