Testing of new tissue-engineered blood vessels in experimental models

Full Text

Общепринятым «золотым стандартом» лечения сердечно-сосудистых заболеваний, обусловленных облитерацией сосудов, являются шунтирующие операции, представляющие собой обход или замену участка сужения за счет трансплантатов и реваскуляризацию зоны ишемии. В кардиохирургии в качестве трансплантата чаще всего используют участок подкожной вены (реваскуляризация сердца и нижних конечностей) и также внутренней грудной артерии для «обхода» коронарных артерий [1]. К сожалению, около 30% пациентов не обладают подходящими для трансплантации венами [1]. В связи с этим возникает необходимость создания альтернативных трансплантатов, которые бы соответствовали всем необходимым биологическим и механическим характеристикам собственных сосудов пациентов.

Основными качествами идеального трансплантата должны быть его биологическая совместимость, прочность, гипоаллергенность и гипоиммуногенность, отсутствие токсичности, низкая стоимость, отсутствие тромбогенности. Однако к настоящему времени ни один из разработанных заменителей сосудов не обладает этими качествами в полной мере [2]. Синтетические, аллогенные и ксеногенные сосуды провоцируют тромбозы, отторжение, хроническое воспаление и имеют весьма посредственные механические свойства. В качестве альтернативы было предложено наносить слой эндотелия на искусственные полимерные протезы на основе политетрафлуороэтилена (ПТФЭ) и полиэтилена тетрафталата. Эндотелизация таких протезов увеличивает биосовместимость конструкции, значительно снижая риск тромбозов и рестенозов. На оформленные синтетические каркасы наносятся матрикс, обеспечивающий нормальную адгезию и пролиферацию клеток и собственные эндотелиальные клетки пациента. Однако «сосуды», полученные таким методом (эндотелизированные протезы), способны обеспечивать нормальную гемоциркуляцию только в течение 3-5 лет и менее чем в 50% случаев [2].

Революционным направлением в сосудистой хирургии может стать применение полноценных тканеинженерных конструкций. Такие биоискусственные сосуды представляют собой дву- или трехслойные тканево-клеточные структуры, выращиваемые в особых условиях in vitro на полом цилиндрическом биодеградируемом матриксе. Первым этапом на биополимер наслаивают гладкомышечные клетки стенки артерий, затем - эндотелиальные клетки и третий слой (присутствующий не всегда) - адвентицию. Конструкция культивируется в специальных биореакторах в режиме «пульсирующей гидродинамической струи» около месяца. В ряде лабораторий такие конструкции были созданы и испытаны in vivo[3]. Уже несколько лет идут клинические испытания тканеинженерных сосудистых графтов, предназначенных, однако, только для протезирования крупных сосудов [3-6]. Замена сосудов меньшего диаметра (менее 6 мм во внутреннем диаметре) остается на данный момент практически нерешенной проблемой в связи с тромбогенностью графтов, провоцируемой ими гиперплазией интимы и атеросклеротическими изменениями [7]. Биоинженерия в этой области пока остается в основном на уровне экспериментов in vitro или использовании животных моделей.

Разрабатываются все новые и новые подходы к проблеме создания тканеинженерных сосудов из аутогенных клеток человека. Недавно группой L’Heureux была предложена новая модель создания таких трансплантатов и получены многообещающие результаты при их испытаниях in vivo. Результаты исследования опубликованы в журнале Nature Medicine.

Для создания трансплантатов исследователи использовали человеческие фибробласты, выделенные из биопсийного материала кожи пациентов с тяжелыми формами сердечно-сосудистых заболеваний. Эти трансплантаты были получены новым методом так называемой «послойной тканевой инженерии». Фибробласты культивировались в условиях, стимулирующих продукцию хорошо организованного внеклеточного матрикса, который формировал плотный «листок», с легкостью отделявшийся от поверхности культурального пластика. Такие «листки», состоящие из внеклеточного матрикса и клеток, могут в дальнейшем использоваться для конструирования трехмерной модели сосуда, обладая всеми необходимыми механическими качествами [8]. Для этого «листки» последовательно оборачивались вокруг временной основы из нержавеющей стали с тефлоновым покрытием, а затем освобождались от фибробластов и засевались клетками эндотелия. В итоге получалась модель, состоящая из адвентиции, бесклеточной внутренней мембраны и эндотелиального внутреннего слоя. Такой биоинженерный сосуд имел внутренний диаметр 4,2 мм при толщине стенки 407 мкм. Испытания физических свойств in vitro (через модель пропускался поток жидкости) подтвердили его прочность.

Затем свойства потенциального графта были проверены in vivo. Сначала человеческие графты (с внутренним диаметром 1,5 мм) были пересажены иммунонекомпетентным крысам (nude) в область абдоминальной части аорты (анастомоз). 12 из 14 «двуслойных» трансплантатов успешно интегрировались в окружающие ткани. Кровотечения обнаружено не было, равно как и сужения просвета сосуда или образования аневризм. Диаметр сосуда оставался стабильным на протяжении всего эксперимента (6 месяцев) и, несмотря на отсутствие применения антикоагулянтов, в 85% процентах случаев не было отмечено образования тромбов. Гистологический анализ трансплантата на 90-й день от начала эксперимента показал целостность мембраны и отсутствие лейкоцитарной инфильтрации. То есть ее матрикс не обладал иммуногенными свойствами и не провоцировал воспалительной реакции, часто приводящей к стенозу. К шестому месяцу толщина сосудистой стенки и внутренний диаметр графта также не изменились. Ультраструктурное исследование выявило организацию клеток и экстраклеточного матрикса, характерные для нормальных тканей. В адвентиции были обнаружены клетки, положительные по а-актину, что может указывать на возможное участие в регенерации гладкомышечных клеток, мигрировавших из мест анастомозов, а также циркулирующих в крови прогениторных клеток.

Сосуды с внутренним диаметром 4,2 мм показали хорошие биомеханические и биологические свойства в стандартном эксперименте (на фоне иммуносупрессии и тромболитиков) по созданию анастомозов на 4 собаках. Чтобы проверить качества трансплантата в более близком к человеческому биомеханическом окружении, графты с внутренним диаметром 4,2 мм были имплантированы трем макакам, которым предварительно была проведена иммуносупрессия. Ультразвуковое исследование, компьютерная томография-ангиография и биопсии подтвердили, что все сосуды не были подвержены клеточной инфильтрации и не демонстрировали никаких признаков сужения или образования аневризм. На гистологических срезах был заметен умеренный иммунный ответ, образование артерио-артериальных анастомозов и покрытая нормальным эндотелием внутренняя мембрана. Также были найдены позитивные по а-актину клетки в составе адвентиции. Более того, такие же клетки присутствовали и в окружающей сосуды ткани.

Таким образом, с использованием оригинального методического подхода [послойное формирование сосуда) были разработаны тканеинженерные трансплантаты, в полной мере обладающие необходимыми для клинического применения качествами. В экспериментах in vivo сосуды продемонстрировали достаточно высокую прочность, стимулировали регенерацию и ангиогенез, препятствовали развитию аневризм. Нормальный эндотелий, выстилающий внутреннюю поверхность графта препятствовал тромбозам и не подвергался лимфоидной инфильтрации.

Это исследование максимально приближено к клинических условиям, поскольку сосуды полностью были «сконструированы» из собственных клеток пациентов. Кроме того, сосуды были испытаны сразу в трех in vivo моделях (крыса, собака, обезьяна). Другим неоспоримым преимуществом работы является то, что авторы изучали «судьбу» сосудов в течение длительного времени - полгода после трансплантации. Можно предположить, что в клинике такие сосуды могут «прослужить» длительное время без развития осложнений. Впервые модель была опробована на приматах, то есть в биомеханическом окружении, практически на 100% соответствующем условиям организма человека. Разработанные трансплантаты успешно зарекомендовали себя в замене поврежденных сосудов и далее могут проходить клинические испытания, которые должны подтвердить эффективность конструкции у пациентов.

About the authors

A. S. Grigoryan

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation

References

Supplementary files