Insufficiency of reprogramming of the hematopoietic stem cell nucleus during its transfer

Full Text

Эксперименты по переносу ядра в энуклеированный овоцит показали, что генетические и эпигенетические изменения, приобретаемые клеткой в процессе дифференцировки, могут быть полностью «репрограммированы». При переносе ядра соматическая клетка может вернуться в плюрипотентное состояние и дать начало новому эмбриону из которого могут быть изолированы совместимые эмбриональные стволовые клетки (embryonic stem cells, ESC) [1]. Однако, частота выделения линии ESC из бластоцисты, полученной переносом ядра крайне низка и составляет в среднем 1 линия из 200-300 переносов. Считается, что частоту удачных попыток переноса может увеличить использование ядер от незрелых стволовых клеток дефинитивных тканей [2]. Так, если донором ядра является ESC, процент рожденных клонированных животных может достигать 20. Если же донор - соматическая дифференцированная клетка, число рожденных плодов значительно снижается. Поэтому, существует предположение, что в дифференцированных соматических клетках генетические и эпигенетические модификации труднее изменить и перепрограммировать в цитоплазме овоцита [1, 2].

В настоящее время, достаточно хорошо охарактеризованы гемопоэтические стволовые клетки (hematopoietic stem cells, HSC). Одна такая клетка способна восстановить гемопоэз летально облученной мыши [3]. Пластичность генома HSC позволяет получить из них клетки не только гемопоэтической линии [4]. Таким образом, HSC могли бы стать хорошим альтернативным донорским источником для переноса ядра и теоретически повысить частоту создания жизнеспособных клонов. Основываясь на этих данных, ученые из RIKEN Bioresource Center (Tsukuba, Japan) проверили гипотезу о том, что эти клетки могут быть «выгодными» донорами ядер для клонирования, так как у них относительно пластичный геном. Авторы протестировали способность к репрограммированию и клонированию HSC, выделенные из самок и самцов мышей разных линий, в сравнении с фибробластами, кумулюсными и клетками Сертоли, стандартно применяющимися для клонирования.

Основная часть реконструированных эмбрионов культивировалась в течение 48 часов, а затем переносилась в организм самки. Во всех экспериментальных группах около 90% клонированных зигот делились в первые 24 часа, однако в течение следующих суток только 34% HSC-образованных эмбрионов давали 4 клетки, тогда как в других группах большинство клонов достигло 4клеточной стадии. Частота развития HSC-эмбрионов в бластоцисту оказалась неожиданно низкой (5,9%), тогда как почти половина (45,8%) клонов из кумулюсных клеток развивалась нормально. Четырехклеточные эмбрионы были перенесены в организм самок-реципиентов. Всего два мышонка родилось из HSC-клонов и только из клеток одной линии. Клонированное потомство родилось во всех контрольных группах: из клеток Сертоли - 6, из кумулюсных - 8 и из фибробластов - 5 мышат. Таким образом, клоны, полученные из HSC, показали самый низкий потенциал развития, как на ранних стадиях развития так и на более поздних.

Считается, что геном донорского ядра «перепрограммируется» при его переносе в цитоплазму овоцита в определенное время, когда происходит переключение активности материнского генома на эмбриональный геном. Это так называемая эмбриональная активация генов (embryonic gene activation, EGA). У мышей эта активация начинается еще на стадии зиготы, но в основном она происходит на двуклеточной стадии [5-7]. Поэтому, скорее всего, остановка в развитии клонированных эмбрионов происходит при нарушении эмбриональной активации генов. Для выяснения молекулярно-генетических причин этого процесса Kimiko Inoue с коллегами исследовали эмбрионы при переходе из 2 в 4-клеточную стадию (точка появления разницы в развитии HSC-эмбрионов). Для сравнения были изучены нормальные эмбрионы, эмбрионы, полученные искусственным оплодотворением и клонированные из HSC и кумулюсных клеток. Авторы выявили, что в эмбрионах, полученных от разных клеток, уровень экспрессии 6-ти основных генов, активных в основной стадии EGA [3-5], различен. Например, уровень транскрипции гена Hdac1 (histone deacetylase 1) был высок во всех трех группах, кроме HSC-эмбрионов. Известно, что этот ген слабо экспрессируется на одноклеточной стадии развития эмбриона и сильнее - на дву- четырехклеточной. Hdac1 взаимодействует с обширной генной сетью и считается ключевым геном деацетилаз, активируемым в эмбрионе сразу после оплодотворения. Возможно, он играет одну из важнейших ролей в регуляции экспрессии генов раннего развития, так как при его подавлении гиперацетилирование гистонов приводит к полной блокировке дальнейшего развития на двуклеточной стадии [8, 9]. Анализ с использованием антител на ацетилированные гистоны в HSC-эмбрионах подтвердил повышенный уровень ацетилирования, то есть пониженная активность Hdac1 ведет к изменениям на хроматиновом уровне. В то же время, гены Endomucin, CD45 и c-kit, которые, как известно, активны в HSC, в клонированных HSC-эмбрионах не транскрибировались.

Авторы работы впервые показали возможность рождения клонированных мышей переносом ядра от донорской HSC. В то же время, ожидалось, что эффективность клонирования будет выше, чем при использовании других соматических клеток, так как геном HSC проявляет большую пластичность. Однако, частота развития клонированных эмбрионов с ядрами HSC оказалось неожиданно низкой, значительно хуже на всех стадиях, начиная с четырехклеточной, сравнительно с клонами, полученными от ядер других клеток-доноров. На основании анализа экспрессии генов было показано нарушение активации эмбрионального генома.

Низкий уровень развития HSC-клонов даже по сравнению с клонами из лимфоцитов [10], говорит о том, что «стволовость» донорского ядра не всегда улучшает эффективность клонирования. Одной из основных причин может быть низкая активность гена Hdad в HSC, что приводит к гиперацетилированию гистонов. Вероятно, что разница в экспрессии проанализированных генов зависит от доступности гиперацетилированной ДНК к транскрипционным факторам.

Дальнейшие исследования помогут проверить эту гипотезу. Несмотря на многочисленные вновь возникшие вопросы, Kimiko Inoue и его коллеги получили важный результат, заключающийся не только в клонировании мышей с использованием HSC, но и в сравнительном анализе, показывающем низкий уровень перепрограммирования ядра HSC. Возможно, что аналогичная недостаточность перепрограммирования будет наблюдаться и с ядрами взрослых стволовых клеток человека. Вопрос выбора оптимальной клетки-донора ядра клонирования остается актуальным.

About the authors

T. V. Lopatina

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation

References

Supplementary files