CD105+ selection is a method of isolation of multipotent mesenchymal stromal bone marrow cells without cultivation

Full Text

Выделение истинных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) является важной задачей в связи с перспективами их терапевтического применения для лечения повреждений костной, хрящевой и мышечной тканей. Одной из основных проблем выделения чистой популяции ММСК является отсутствие единого мнения по фенотипической характеристике этих клеток. Довольно широко используемым методом выделения ММСК остается селекция в культуре по способности адгезии к пластику. Однако этот метод позволяет получить довольно гетерогенную популяцию клеток и требует определенного времени культивирования. Выделение клеток методами флюоресцентного или магнитного сортинга имеет ряд преимуществ по сравнению с селекцией популяции в культуре. Во-первых, это высокая чистота популяции (80-90% и более) и высокая скорость селекции. Во-вторых, культивирование несет в себе более высокий риск микробной контаминации и контаминации ксеногенными белками (сыворотка животных и заменители), а также удлиняет время селекции. Длительная экспансия ММСК, как правило, требует больших временных и материальных затрат, кроме того эти клетки спонтанно могут изменять свои свойства в культуре [1, 2]. В связи с этим, использование методик, позволяющих быстро и селективно выделять истинные ММСК без процесса культивирования, вызывает большой интерес. Ранее для выделения высокоочищенной популяции ММСК без культивирования различными исследовательскими группами были предложены методы селекции по маркерам, высокоэкспрессирующимися этими клетками - STRO-1 [3, 4] и CD105 [5, 6].

Недавняя работа израильских ученых, опубликованная в он-лайн версии журнала Stem Cells, посвящена изучению остеогенных свойств популяции некультивированных ММСК, выделенных непосредственно из костного мозга человека с помощью иммуномагнитного сортинга. Выделение клеток было основано на их позитивной селекции по маркеру CD105 (эндоглин). Но в отличие от предыдущих работ, описывающих аналогичный метод [5, 6], авторы впервые исследовали мультипотентность этих клеток перед процессом экспансии (селекции) в культуре и продемонстрировали их высокую способность к остеогенной дифференцировке in vitro и in vivo.

По результатам исследования CD105+ фракция после селекции на магнитных бусах составила 2,3% от всех мононуклеарных клеток костного мозга. Чистота выделения фракции составила 79,7%. CD105+ клетки были способны образовывать в 6 раз больше фибробласт-подобных колоний, чем нефракционированные ядросодержащие клетки из костного мозга. Кроме того, CD 105+ клетки после экспансии в культуре экспрессировали маркеры - CD105, CD44, CD29, CD90 и CD106, но не CD14, CD34, CD45, CD31, то есть имели типичный фенотип ММСК. Эти клетки были способны дифференцироваться в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях.

Важным функциональным тестом, демонстрирующим остеогенный потенциал свежевыделенных CD105+ клеток, стало изучение их способности отвечать на присутствие рекомбинантного BMP-2 in vivo. Для этого стимулированные BMP-2 клетки метили липофильным красителем DiI, помещали на коллагеновую губку и пересаживали NOD/SCID-мышам под кожу. При исследовании срезов под конфокальным микроскопом были обнаружены участки новообразования кости и хряща с участием меченых клеток.

Кроме того, исследователи продемонстрировали способность CD105+ клеток к трансфекции генетическими конструкциями, несущим гены LacZ и GFP. Эффективность составила 10% и 44% соответственно. Эти конструкции часто используются для идентификации меченых клеток после трансплантации. Таким образом, авторы показали, что данный тип ММСК может широко использоваться для тестирования в экспериментальных моделях, изучающих эффективность методов клеточной трансплантации и тканевой инженерии.

Метод одношаговой селекции высокоочищенной популяции ММСК методом иммуномагнитного сортинга по CD105 позволяет упростить процесс выделения и избежать значительных потерь клеток на каждом этапе. Авторы работы впервые показали, что потенциал к дифференцировке свежевыделенных ММСК сходен с таковым, при выделении другими ранее описанными методами. Это исследование еще раз продемонстрировало, что коммерчески доступные антитела к CD105 могут быть использованы для высокоселективного сортинга ММСК [5, 6]. Чистоту популяции (~ 80%) видимо можно будет увеличить, используя флюоресцентный сортинг. Тем не менее, для решения окончательного вопроса правомочности применения CD105+ или STRO-1 + ММСК в клинике, необходимо проведение дополнительных сравнительных исследований (с культивированными ММСК) в различных экспериментальных моделях.

В связи с перспективами одношагового выделения ММСК компании-производители реагентов для работы со стволовыми клетками уже сегодня предлагают новейшие киты, основанные на селекции ММСК по экспрессии одного более селективного маркера [7, 8]. Коммерческая доступность антител к CD105 сделает метод высоковоспроизводимым в различных лабораториях. Это еще одно преимущество такого подхода по сравнению с экспансией ММСК в культуре, где чистота популяции зависит от множества факторов. Кроме CD105 в качестве кандидатуры для сортинга ММСК также был предложен рецептор к фактору роста нервов (CD271) [8]. Еще одним перспективным подходом можно считать выделение мобилизованных ММСК из периферической крови на магнитных бусах, покрытых фибрином, описанным совсем недавно [9]. Таким образом, выбор оптимального маркера для выделения ММСК из любого источника на данный момент ограничивается спектром коммерчески доступных реагентов для выделения и степенью экспрессии выбранной молекулы.

About the authors

V. S. Melikhova

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation

References

Supplementary files