Comparative analysis of the regenerative potential of blood derivatives on a cell model of corneal stromal injury

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Помутнение роговицы занимает 5-е место среди ведущих причин слепоты во всём мире (3,2% всех случаев) [1]. Любое серьёзное повреждение роговицы с вовлечением её стромы (травмы, инфекции, дегенерации) может привести к помутнению роговицы, формированию лейкомы и, как следствие, к понижению остроты зрения. 5% случаев слепоты могут быть связаны с травмой глаза и вызванной ею инфекцией, при этом одной из самых распространённых причин является инфекционный кератит [2, 3]. Строма — самый «массивный» из слоёв роговицы. «Активная» её часть состоит из кератоцитов — клеток мезенхимального происхождения с функцией производства компонентов стромы (коллагена и гликозаминогликанов). Упорядоченность и определённое соотношение этих компонентов обусловливают поддержание прозрачности роговицы [4]. Ранее считалось, что кератоциты никак не реагируют на травму эпителия роговицы, однако в некоторых работах при гистологическом исследовании ткани отмечено отсутствие кератоцитов в локализации после соскоба эпителия [5]. Позже было показано, что повреждение эпителия роговицы и проникновение цитокинов через повреждённую боуменову мембрану запускает апоптоз кератоцитов в передних слоях стромы [6]. J. Zieske и соавт. [7] сообщили о том, что кератоциты в задних слоях стромы, окружающих бесклеточную зону повреждения, начинают пролиферировать через 12–24 ч после травмы. Таким образом, строма не является пассивным элементом, а активно реагирует и вовлекается в процессы регенерации, даже если в ней не происходит потери вещества ткани. При повреждении же стромы роговицы (травма, воспаление, расплавление), в результате которого происходит потеря объёма ткани, для эффективного восстановления повреждённой области фибробласты, прилегающие к ней, должны размножиться и мигрировать, чтобы восстановить объём ткани [8]. Заживление дефектов роговицы является результатом комплекса активных клеточных и внеклеточных процессов, регулируемых цитокинами и факторами роста [9]. Если объём повреждения слишком велик или есть отягощающие факторы (инфекция), то заживление может не происходить совсем или происходить не полностью. Исходя из вышесказанного, актуальна разработка способов стимуляции регенерации и процессов заживления, особенно в тех случаях, когда дефект толерантен к стандартным консервативным методам лечения.

В последние годы аутологичную сыворотку, богатую тромбоцитами плазму (БоТП, англ. platelet rich plasma, PRP), а также плазму, обогащённую факторами роста, и лизат тромбоцитов широко используют в виде глазных капель для лечения ряда заболеваний поверхности глаза, таких как синдром сухого глаза, эрозии различной этиологии и язвы роговицы [10]. Благоприятный эффект, получаемый при использовании препаратов крови в виде глазных капель, по всей вероятности, связан с их высокой биосовместимостью, биофизическими свойствами, которые аналогичны слезе, включая pH, осмолярность, противомикробное и противовоспалительное действие [11–13]. Аутологичная сыворотка крови — одна из самых простых технически выполнимых форм получения активного деривата крови, и отчасти поэтому именно она наиболее распространена для терапевтического применения. Трендом последних лет является применение более «концентрированных» субстанций, получаемых путём сбора фракции крови, богатой тромбоцитами. Они позволяют в малом объёме создать высокую концентрацию активных веществ, способствующих регенерации. К числу наиболее изученных компонентов относятся эпидермальный фактор роста (EGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), трансформирующий фактор роста-β1,2 (TGF-β1,2) и инсулиноподобный фактор роста-I (IGF-I).

И сыворотку, и тромбоконцентраты получают без добавления каких бы то ни было фармакологических субстанций. Активация процессов высвобождения ростовых факторов и цитокинов опосредуется окружающими физико-химическими условиями, приводящими к запуску каскада свёртывания крови и дегрануляции тромбоцитов.

В то же время получать дериваты крови с «управляемым» составом возможно. Ведь находящиеся в циркуляции лейкоциты синтетически активны. Добавляя к ним активное вещество, воздействующее, например, на систему защиты от патогенов (толл-подобные рецепторы), можно «настраивать» вырабатываемый лейкоцитами «коктейль» цитокинов для противовирусной/антибактериальной/антигрибковой защиты. Примером такого «модифицированного» деривата крови может служить процессированная аутологичная сыворотка (ПАС), при получении которой к клеткам крови добавляют мимикрирующий под вирусную РНК комплекс полиадениловой-полиуридировой кислот, являющийся лигандом толл-подобных рецепторов 3-го типа. Получаемый в результате такой обработки дериват крови имеет цитокиновый состав, отличный от интактной сыворотки и плазмы крови. В нём повышено содержание цитокинов, работающих на «первой линии защиты» от патогенов, — ИЛ-1, -6, -8, ФНО-α, ИФ-α.

Опыт применения препаратов крови в различных сферах медицины показывает ускорение процессов восстановления тканей и заживления ран при их воздействии [14, 15]. Очевидно, что эффект таких комплексных препаратов не может быть опосредован через один определённый фактор, а служит результатом всех вовлечённых механизмов — пролиферации, миграции, гибели и дифференцировки клеток [16]. В связи с этим возникает необходимость изучить влияние препаратов крови как стимуляторов этих видов клеточной деятельности.

Цель исследования — анализ влияния различных типов дериватов крови на способность клеточной культуры кератоцитов к пролиферации и миграции клеток, а также оценка клеточной гибели.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Получение дериватов крови

Кровь забирали из локтевой вены здоровых добровольцев после подписания информированного согласия на участие в исследовании. Для получения сыворотки 9 мл цельной крови забирали в пробирку без антикоагулянта, после свёртывания крови в течение 2 ч при комнатной температуре и последующего центрифугирования в режиме 1000 g в течение 15 мин (центрифуга фирмы ELMI CM-6М, Латвия) собирали бесклеточную часть.

Для получения PRP кровь забирали в пробирку с 3,8% цитратом натрия (VACUETTE; Greiner Bio-One, Австрия), после двукратного центрифугирования (первое — 900 g в течение 5 мин, затем сбор плазмы и второе — 1500 g в течение 10 мин) верхние 2/3 супернатанта убирали, оставляя нижнюю треть — PRP.

Процессированную аутологичную сыворотку получали, забирая 8 мл цельной крови из локтевой вены в пробирку с раствором полиА:У (препарат Полудан®, ООО «Верофарм», РФ) (2 ампулы на 2 мл воды для инъекций). После инкубации в течение 3 ч при 37 °С и последующего центрифугирования в режиме 1000 g в течение 15 мин собирали надосадок.

Получение клеточной культуры и её характеристика

Первичная клеточная культура кератоцитов роговицы человека взята из кадаверного материала (корнеосклерального кольца, не востребованного в ходе кератопластики) эксплантным методом. Материал в виде корнеосклеральных лоскутов получали из глазного банка ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней имени М.М. Краснова». Исследование одобрено на заседании локального этического комитета от 08.07.2021 г., протокол № 79/2. Центральная роговичная часть консервированного в среде Борзенка–Мороз корнеосклерального лоскута была пересажена реципиенту, а периферическая часть — использована в эксперименте. Фрагменты лимбальной зоны располагались на поверхности культурального пластика в капле сыворотки, через сутки добавляли питательную среду. Через неделю наблюдали выход клеток из экспланта. По достижении конфлюэнтности клетки пассировали в соотношении 1:3. Клетки выращивали на среде RPMI-1640 (Gibco, США) с 10% фетальной бычьей сывороткой (HyClone, США), 2 мМ глютамина, раствором антибиотиков/антимикотика (Gibco, США) в стандартных условиях (37 °C, 5% CO₂ и 100% влажности). Смену среды осуществляли раз в 2–3 дня.

Наблюдение за ростом клеток проводили с помощью микроскопа AxioVert A1 (Carl Zeiss, Германия). В исследовании использовали клетки 3-го пассажа. Перед оценкой регенераторного потенциала производных крови выполняли суточную депривацию по сыворотке. Контрольную группу составили клетки, культивированные без воздействия дериватов крови как стимулятора клеточной деятельности, т.е. в «пустой» среде.

Анализ миграции клеток

Для исследования влияния стимуляторов на миграцию клеток провели тест на заращивание раны монослоя. С этой целью клетки рассевали на 24-луночные планшеты в плотности 30 тыс./см² за сутки до исследования, после чего на дно, покрытое слоем клеток, наносили дозированную (одинаковую во всех лунках) «царапину» носиком пипетки. После этого лунки промывали и вносили среду со стимуляторами. Доля стимуляторов составляла 10%. Динамику заживления — площадь «раны» (бесклеточную зону) — оценивали в программе ImageJ после ручной обводки на изображениях, полученных с микроскопа AxioVert A1 на фотокамеру Canon 600D (Canon, Япония) через 6, 17 и 24 ч после внесения стимуляторов. Исследования проводили в триплетных повторах.

Оценка метаболической активности клеток

Для исследования влияния стимуляторов на активность клеточных процессов выполнен колориметрический формазановый MTS-тест, отражающий уровень метаболической активности исследуемых клеток, в ходе которого живые активные клетки переводят неокрашенный реактив CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, США) в окрашенную форму. Таким образом, светопропускание в лунке планшета пропорционально количеству живых активных клеток в ней. Для этого теста клетки высевали в лунки 96-луночного планшета за сутки до тестирования в концентрации 10 тыс./см². Стимулятор добавляли в концентрации 10% от объёма среды. Анализ выполняли через 24 ч. Коэффициент пропускания измеряли на фотометре Muliscan-FC (Тhermo Fisher Scientific, США) при длине волны 492 нм. Все исследования выполнены в четырёх повторах.

Анализ митотической активности

Оценку митотической активности выполняли с помощью иммуноцитохимического окрашивания после формалиновой фиксации клеток, засеянных на чашки с вставками для микроскопии (SPL, Корея) на белок-маркёр пролиферации Ki-67, моноклональными антителами (Ki-67 Monoclonal Antibody (20Raj1; eBioscience™, Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, US) в разведении 1:200, в условиях инкубации в течение 2 ч при комнатной температуре. Проведены иммуноцитохимическое окрашивание вторичными антителами Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 594 (Invitrogen, США) в разведении 1:1000 и инкубация в течение 2 ч при комнатной температуре. Докрашивание ядер осуществляли красителем Hoechst 33342 (Invitrogen, США) в концентрации 1 мкг/мл. Было просчитано 10 полей зрения в каждой группе (от 500 до 1500 клеток).

Оценка клеточной гибели

Для оценки апоптоза и некроза в культуре клеток использовали набор ApoDETECT Annexin V-FITC (Invitrogen, США). Отбирали каплю (10 мкл) окрашенной клеточной суспензии и переносили на предметное стекло. Анализ окрашенных клеток выполняли с помощью микроскопии в тёмном поле с длиной возбуждения флуоресценции 450–490 нм и эмиссии 515 для регистрации сигнала FITC, для PI длина возбуждения составляла 548 нм, эмиссии — 590 нм. Было просчитано 5 полей зрения в каждой группе (от 500 до 2000 клеток).

Статистический анализ

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 5. Критерий Манна–Уитни использовали для попарного сравнения групп при уровне значимости р <0,05. Для множественного сравнения применяли дисперсионный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Тест на закрытие раны монослоя продемонстрировал, что все три стимулятора способствуют ускорению процесса закрытия оголённой поверхности. Уже через 18 ч свободная площадь в группах со стимуляцией статистически значимо сократилась. При этом наибольшие темпы заращивания продемонстрировали образцы, стимулированные ПАС, чуть меньше — сыворотка и затем — PRP (рис. 1).

 

Рис. 1. Графическое отображение динамики «закрытия» экспериментальной раны, M±σ; * статистически значимые различия с контролем. PRP — богатая тромбоцитами плазма, Сыв — интактная сыворотка, ПАС — процессированная аутологичная сыворотка.

Fig. 1. Graphical dynamics of the experimental wound’s “closure”, M±σ; * significant differences with control. Контроль — control, PRP — platelet rich plasma, Сыв — intact serum, ПАС — processed autologous serum.

 

Такая же тенденция сохранилась и через сутки, когда в образцах, стимулированных ПАС и сывороткой, экспериментальная рана закрылась полностью.

Тест на метаболическую активность не выявил значимых различий между группами с различными стимуляторами (рис. 2). Хотя средние значения в группах после воздействия дериватов крови были выше, чем в контрольной, статистические критерии не показывают наличия различий. Вероятно, для развития значимого эффекта требуется больше времени, чем 24 ч.

 

Рис. 2. Графическое отображение влияния производных крови на метаболическую активность кератоцитов, M±σ. PRP — богатая тромбоцитами плазма, Сыв — интактная сыворотка, ПАС — процессированная аутологичная сыворотка.

Fig. 2. Graph of the influence of blood derivatives on the metabolic activity of keratocytes. M±σ. Контроль — control, PRP — platelet rich plasma, Сыв — intact serum, ПАС — processed autologous serum.

 

Анализ влияния стимуляторов на экспрессию белка-маркёра пролиферативной активности Ki-67 выявил следующую тенденцию: контрольная культура была полностью отрицательна по этому параметру (рис. 3). Установлено также, что из стимуляторов наибольшим эффектом по стимуляции включения в пролиферативный цикл обладает сыворотка (детектировано 2,6% клеток, положительных на Ki-67). Чуть меньшие цифры продемонстрировала PRP — 1,9%. При стимуляции ПАС лишь 0,6% клеток оказались положительными.

 

Рис. 3. Репрезентативные поля зрения при окрашивании монослоя кератоцитов на белок Ki-67 (розовый канал); синий канал — окрашивание ядер Hoechst 33342. Стрелками обозначены Ki-67-позитивные клетки в процессе подготовки к делению: а — контроль; b — после внесения сыворотки; c — после внесения PRP; d — после внесения ПАС. Бар — 100 мкм.

Fig. 3. Representative fields of view when staining a monolayer of keratocytes for Ki-67 protein (pink channel), blue channel staining for Hoechst 33342 nuclei. Arrows indicate Ki-67 positive cells in preparation for division: a — control; b — after addition of serum; c — after PRP application; d — after the addition of PAS. The scale bar is 100 µm.

 

Уровень клеточной гибели после экспозиции кератоцитов с дериватами крови значимо увеличивался по сравнению с контролем только в группе, стимулированной сывороткой, и составил 12,8% (рис. 4). При этом некротическая гибель зафиксирована в 5,9%, апоптотическая — в 6,9% случаев. После экспозиции с PRP апоптотическая гибель была зафиксирована даже в меньшем проценте случаев, чем в контроле, и составила 1,1%, однако уровень некроза был высоким (4,4%) и суммарный показатель клеточной гибели в этой группе не отличался от контрольной (5,5%). При воздействии ПАС уровень детектированной клеточной гибели был статистически значимо ниже, чем в контрольной группе, и составил 2,4% (1,5% гибель путём апоптоза, 0,9% — некроза) по сравнению с 4,3% в контроле (2,5 и 1,8% соответственно).

 

Рис. 4. Графическое отображение доли погибших кератоцитов при стимуляции производными крови и в контроле; * статистически значимые различия с группой контроля. PRP — богатая тромбоцитами плазма, ПАС — процессированная аутологичная сыворотка.

Fig. 4. Graph of the proportion of dead keratocytes during stimulation with blood derivatives and in control; * significant differences with the control group. Контроль — control, PRP — platelet rich plasma, сыворотка — intact serum, ПАС — processed autologous serum.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют об общем положительном влиянии дериватов крови на регенерацию в культуре кератоцитов. Очевидно также и то, что их эффект реализуется через разные механизмы — сыворотка является наиболее «мощным» активатором деления, активно стимулирует миграцию, однако при этом увеличивает уровень гибели клеток. ПАС максимально активирует миграционные способности клеток, уменьшая при этом уровень некроза и апоптоза и незначительно стимулируя деление. Возможно, что миграционная активность кератоцитов усиливается из-за высокого содержания в ПАС ИЛ-8, чья функция — привлечение миграционно-активных клеток [17]. Наблюдающийся эффект ПАС по снижению уровня гибели клеток согласуется с ранее опубликованными данными о влиянии полиА:У на выживаемость лейкоцитов [18].

По всей вероятности, использование для стимуляции клеток и приготовления процессированного деривата крови другого стимулятора — лиганда других типов толл-рецепторов (например, 2-го и 4-го типов, ответственных за защиту от бактерий) — дало бы иные эффекты. Этот факт является предметом дальнейшего изучения.

Богатая тромбоцитами плазма занимает промежуточное место по уровню стимуляции деления и в меньшей степени, чем остальные дериваты, стимулирует миграцию, однако снижает уровень апоптоза в культуре. Некротическая гибель при этом увеличивается, оставляя общие цифры гибели на уровне контроля.

Похожая вариативность эффектов между различными дериватами крови описана и другими авторами. Так, при сравнении эффекта тромбоцитарного лизата и бычьей фетальной сыворотки на клетки стромы роговицы зарегистрировано большее увеличение пролиферации и экспресии Ki-67 после применения лизата тромбоцитов по сравнению с фетальной сывороткой [19]. В другой работе отмечено более значимое усиление пролиферации и миграции стромальных клеток после стимуляции PRP по сравнению с сывороткой [20]. Следует отметить, что в настоящей работе наблюдали обратную тенденцию: эффект сыворотки был более выражен по сравнению с PRP. Возможно, различия обусловлены разной методикой постановки эксперимента и степенью обогащения тромбоконцентрата.

Ранее было показано, что PRP снижает уровень апоптоза в культурах стромальных клеток по сравнению с контрольной группой уже через 4 ч экспозиции и эффект сохраняется до 3–5 дней [21]. Результаты, полученные в представленном исследовании, согласуются с этими данными.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Дериваты крови положительно влияют на регенерацию экспериментального стромального дефекта. Препараты на основе сыворотки обладают более выраженным стимулирующим миграцию действием, чем тромбоконцентрат. Деление клеток сильнее всего активизируется сывороткой. Наименьший процент гибели клеток наблюдается в группе с процессированной сывороткой.

Целесообразны дальнейшие исследования для изучения различий в воздействии каждого из дериватов крови на процессы, вовлечённые в регенерацию стромы, апробирование различных типов стимуляторов регенерации на основе препаратов крови для их патогенетически ориентированного использования. К примеру, при поверхностных изъязвлениях быстрая миграция кератоцитов в область дефекта (стимулированная препаратами сыворотки) будет ускорять заживление, а повышенный уровень клеточной гибели не позволит развиться фиброзу за счёт элиминации миофибробластов. В случае же инфекционного процесса с потерей значительного объёма вещества роговицы более целесообразно применять стимуляторы с антиапопототическим действием — процессированную аутологичную сыворотку и обогащённую тромбоцитами плазму.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: А.М. Суббот — дизайн исследования, экспериментальные процедуры, анализ полученных результатов, сбор и анализ литературных источников, подготовка и написание текста статьи; Е.А. Каспарова — разработка дизайна исследования, сбор экспериментального материала, экспериментальные процедуры, написание и редактирование текста статьи; Д.А. Криволапова — обзор литературы, сбор экспериментального материала, сбор и анализ литературных источников, написание текста и редактирование статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors' contribution. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors have made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication). The author contribution is distributed as follows: A.M. Subbot — development of research design, experimental procedures, analysis of experimental data, collection and analysis of literary sources, preparation and writing of the text of the article; E.A. Kasparova — development of research design, collection of experimental materials, experimental procedures, writing and editing the text of the article; D.A. Krivolapova — literature review, collection of experimental material, collection and analysis of literary sources, writing the text and editing the article.

About the authors

Anastasia M. Subbot

M.M. Krasnov Research Institute of Eye Diseases

Email: kletkagb@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8258-6011
SPIN-code: 3898-2570

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Evgeniya A. Kasparova

M.M. Krasnov Research Institute of Eye Diseases

Email: kasparova_jane@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8594-2395
SPIN-code: 9019-6581

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Diana A. Krivolapova

M.M. Krasnov Research Institute of Eye Diseases

Author for correspondence.
Email: dia.med94@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6974-7872
SPIN-code: 4861-4771

PhD, Student

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files