Т-клеточная вакцинация в лечении рассеянного склероза

Полный текст

Рассеянный склероз (PC) — нейродегенеративное заболевание до конца не ясной этиологии. В мире PC болеет около 3 млн человек. Женщины болеют PC в 1,5—2 раза чаще, чем мужчины. PC обычно начинает проявлять себя в возрасте 20—40 лет. В 90% случаях начало заболевания протекает в ремиттирующей форме, при которой периоды обострения чередуются с периодами полной или частичной ремиссии. С каждым обострением тяжесть заболевания и выраженность неврологических симптомов обычно усиливаются. С течением времени примерно в 50% случаев PC приобретает вторично-прогрессирующее течение, при котором наблюдается неуклонное нарастание тяжести заболевания. У10% пациентов исходно имеет место первично-прогрессирующее течение заболевания без отчетливых обострений и ремиссий [1, 2]

Патогенез рассеянного склероза

Клинические проявления PC являются следствиям развития демиелинизирующих очагов воспаления в центральной нервной системе (ЦНС). Аутоиммунная природа этого заболевания имеет как экспериментальные, так и клинические подтверждения [2, 3]. При PC аутоиммунная агрессия может быть направлена на основной белок миелина (МBР, myelin basic protein), протеолипидный протеин (PLP, proteolipid protein), связанный с миелином гликопротеин (MAG, myelin-associated glycoprotein), миелиновый олигодендроцитный гликопротеин (MOG, myelin oligodendrocyte glycoprotein) и, возможно, другие миелиновые антигены. Немиелиновые нейроантигены могут быть также вовлечены в иммунопатологический процесс. В частности, имеются данные, предполагающие значимость в развитии PC иммунных реакций, направленных на кальций-связывающий белок астроглии (S100β, calcium-binding protein of astroglia) [1]. В момент обострения у больных PC часто выявляется повышенная активность миелин-реактивных Т-клеток на иммунодоминантные регионы основного белка миелина (аминокислоты 83-99 и 151-170). В состоянии ремиссии эта Т-реактивность может исчезать и появляться реактивность, направленная на другие детерминанты [4].

Имеются данные, указывающие на то, что развитие PC ассоциируется с определенными инфекциями [5, 6]. Отсутствие у мышей MyD88-/- адапторной молекулы MyD88 (myeloid differentiation factor 88), которая является внутриклеточным посредником сигналов, формирующихся в результате взаимодействия TLRs (Toll- like receptors) с их микробными лигандами, делает этих мышей полностью резистентными к индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита ОАЭ) [7]. На значимость инфекционных субстратов в развитии демиелинизирующего воспаления также указывают данные о повышенной экспрессии TLRs в ткани мозга энцефаломиелитных мышей и о способности микробной ДНК (лиганд для TLR9) способствовать развитию ЭАЭ [7, 8]. Наиболее вероятными кандидатами на участие в патогенезе PC являются вирус Эпштейна — Барр и вирус герпеса 6-го типа [9, 10].

Выявлено существование генетической предрасположенности к развитию PC. Такая предрасположенность, по-видимому, связана с определенными HLA-DR антигенами [2].

Считается, что ключевая роль в развитии PC принадлежит CD4⁺ Т-хелперным клеткам 1-го типа (Тх1), способным в присутствии нейроантигенов активироваться и продуцировать провоспалительные медиаторы, напрамер, интерферон-γ (ИФ-γ), фактор некроза опухоли (ФНО) и интерлейкин-2 (ИЛ-2). Через локальную продукцию провоспалительных цитокинов Тх1 привлекают в очаг воспаления CD8⁺ клетки и макрофаги и способствуют реализации их цитотоксического потенциала. В частности, ИФ-γ индуцирует цитотоксическую активацию макрофагов и клеток микроглии, а также усиливает экспрессию в клетках нервной ткани продуктов главного комплекса гистосовместимости I класса, которые необходимы для активации и реализации цитотоксического действия CD8⁺ Т-клеток [1, 2].

Важную роль в развитии PC отводят недавно описанным CD4⁺ Т-хелперным клеткам 17-го типа (Тх17). В модели ЭАЭ показано, что, продуцируя ИЛ-17 и ИЛ- 22, эти клетки увеличивают проницаемость гемато-энцефалического барьера (ГЭБ). Повышенная проницаемость ГЭБ способствует попаданию нейроантигенов на периферию, активации и пролиферации там миелин-реактивных Т- и В-клеток и последующему проникновению этих клеток в ЦНС [11, 10]. Важно, что только активированные, но не покоящиеся лимфоциты способны проникать через ГЭБ [1]. Проникшие в мозг активированные CD4⁺ Т-клетки способны вызывать нейротоксический эффект не только опосредованно — через продукцию цитокинов, но и непосредственно — через контактное межклеточное взаимодействие. Значимая роль в этом взаимодействии может принадлежать Fas лиганду, а также молекулам LFA-1 и CD40 [12, 1].

В патогенез PC вовлечены не только хелперные и эффекторные, но и естественные регуляторные Т-клетки (Трег). Биологическая функция этих клеток — поддержание клонального баланса среди лимфоидных клеток и предотвращение избыточной активации иммунной системы. Естественные Трег экспрессируют на своей поверхности СD25-маркер, представляющий собой альфа-цепь рецептора к ИЛ-2. Ключевым фактором, вовлеченным в иммуносупрессорную функцию CD4⁺CD25⁺Трег, является транскрипционный фактор FOXp3 (forhead box рЗ). Этот фактор в комбинации с ядерным фактором активированных Т-клеток (NFAT, nuclear factor of activated T-cells) ингибирует продукцию Т-клетками ИЛ-2 и усиливает экспрессию молекул CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen-4). Установлено, что у больных PC количество Трег в крови, так и экспрессия ими фактора FOXp3 снижены [13]. Развитию PC может также способствовать недостаточная функциональная активность регуляторных СD4⁺Т-кпеток, продуцирующих ИЛ-10 [14, 15], а также сниженная иммуносупрессорная активность CD8⁺ лимфоцитов [16].

У 95% больных PC в цереброспинальной жидкости обнаруживаются IgG антитела олигоклонального происхождения. Определение этих антител имеет диагностическую значимость. Миелин-реактивные антитела могут участвовать в разрушении миелина с вовлечением комплемента или клеточных эффекторов. Во втором случае механизм антителозависимой цитотоксичности реализуется через FcR-опосредуемое взаимодействие [1, 17].

Действие миелин-реактивных Т-лимфоцитов и антител запускает цепь биохимических процессов, способствующих разрушению миелина. Определенный вклад в разрушение миелина вносит оксид азота (NO), вырабатываемый локально активированными макрофагами и клетками микроглии. Механизм цитотоксического действия NO связан с его разрушительным действием на митохондрии. Развитию нейродегенеративного процесса может также способствовать нейротоксический глютамат, накопление которого отмечено в очагах демиелинизации. Болезнь также затрагивает экстрацеллюлярный матрикс. В воспалительных очагах наблюдается повышенная активность металлопротеиназ. Эти ферменты повышают проницаемость ГЭБ и, тем самым, способствуют прохождению через ГЭБ клеток и молекул, обладающих провоспалительной активностью [1].

Очевидно, что иммунотропное лечение PC должно быть направлено на разрушение или формирование антигенной ареактивности аутоиммунных Т- и В-лимфоцитов; усиление активности естественных и индуцированных Трег; и подавление осуществляемой иммунокомпетентными клетками продукции провоспалительных медиаторов, вызывающих разрушение нервной ткани. Т-кпеточная вакцинация представляется одним из наиболее перспективных методов решения этих задач, поскольку подразумевает возможность достижения длительной инактивации аутоиммунных Т-лимфоцитов, играющих ключевую роль в развитии PC.

Т-клеточная вакцинация в лечении рассеянного склероза

Вариабельные части Т-клеточных рецепторов (ТКР) формируются в постнатальный период. Это означает, что по отношению к ним в организме нет врожденной иммунологической толерантности. Вариабельная часть антиген-реактивного ТКР, являющаяся потенциально иммуногенной, называется идиотипической. Вариабельная часть другого ТКР, способного распознать идиотипический пептид ТКР в комплексе с молекулой главного комплекса гистосовместимости, называется антиидиотипической. Назначение антиидиотипических Т-клеток — сдерживание пролиферативной и функциональной активности идиотипических Т-клеток. Нормальный Т-кпеточный спектр формируют как идиотипические, так и антиидиотипические Т-клетки. Предполагается, что часть Трег представлена антиидиотипическими Т-клетками [18]. Логично полагать, что аутоиммунное заболевание в той или иной степени является следствием нарушения функционального баланса между аутоантиген- и ТКР-реактивными лимфоцитами. Метод Т-клеточной вакцинации нацелен на нормализацию баланса между идиотип-несущими аутоиммунными Т-клетками и контролирующими их активность антиидиотипическими Т-лимфоцитами. В случае PC вакцинация пациента инактивированными миелин-реактивными Т-кпетками нацелена на стимуляцию антиидиотипических иммунных реакций, препятствующих развитию аутоиммунного демиелинизирующего процесса.

В первом клиническом исследовании, выполненном в 1992 г., 4 пациента с PC были вакцинированы фиксированными клонированными Т-клетками, которые были получены из цереброспинальной жидкости и размножены in vitro посредством стимуляции фитогемагглютинином (ФГА). Каждый пациент получил в общей сложности 7 подкожных инъекций. Было установлено, что такая аутовакцинация не имеет побочных эффектов и приводит к повышению иммунореактивности, выявляемой в аутогенной смешанной культуре лимфоцитов [19]. Несколько позже были опубликованы результаты исследования, в котором 6 пациентов были вакцинированы облученными аутогенными Т-клеточными клонами, специфичными к основному белку миелина (ОБМ). Каждый пациент получил 3 инъекции с интервалом 2—4 мес. Это исследование подтвердило отсутствие серьезных побочных эффектов у этого метода лечения и впервые показало взаимосвязь положительной клинической динамики с делецией ОБМ-реактивных Т-клеток [20, 21]. Сходные данные были получены в исследовании, в котором 4 пациента были вакцинированы аутогенными, облученными миелин-реактивными Т-клетками. Индукция антиидиотипического иммунного ответа приводила к элиминации миелин-реактивных Т-клеток и ассоциировалась с торможением развития заболевания [22].

Таким образом, данные первых клинических исследований указывали на безопасность и возможную клиническую эффективность применения Т-клеточной вакцинации у больных PC. Эти данные послужили обоснованием для проведения расширенных клинических исследований. В одном исследовании 54 пациента (28 с ремиттирующим и 26 — с вторично-прогрессивным течением болезни) были вакцинированы ОБМ-реактивными клонированными Т-лимфоцитами и далее наблюдались в течение двух лет. В течение 12 мес. после окончания лечения торможение развития болезни было отмечено у большинства пациентов. Важно заметить, что у части больных по истечении этого периода была выявлена тенденция к ускорению прогрессии заболевания. По мнению авторов, такое ускорение можно объяснить диверсификацией клональной структуры аутоиммунных лимфоцитов, произошедшей под влиянием Т-клеточной вакцинации [23]. В другом исследовании для вакцинации 20 пациентов с агрессивным ремиттирующим течением PC были использованы Т-клеточные линии, специфичные к иммунодоминантным пептидам, ОБМ и миелиновому олигодендроцитному гликопротеину. Каждый пациент получил 3 вакцинации. Временной интервал между вакцинациями составлял 6—8 нед. В результате проведенного лечения количество обострений заболевания за год в среднем сократилось с 2,6 до 1,1 (Р = 0,026). В сравнении с данными предыдущего однолетнего периода наблюдения, неврологическое состояние вакцинированных пациентов в течение года не претерпело заметных ухудшений. На благоприятные результаты лечения также указывали данные МРТ, свидетельствующие о статистически значимом уменьшении количества и размеров активных воспалительных очагов в головном мозге [24].

В нашем институте разработана двухэтапная технология получения поликлональной Т-клеточной вакцины. На первом этапе лимфоциты пациента подвергаются культуральной селекции в присутствии миелиновых антигенов, тогда как на втором этапе миелин-реактивные Т-клетки наращиваются посредством неспецифической стимуляции (ФГА+ИЛ-2) [25]. Полученная таким образом вакцина была применена при лечении 28 пациентов (возраст от 26 до 50 лет; давность заболевания — не менее 2 лет) с разными формами PC. За время наблюдения серьезных неблагоприятных побочных эффектов вакцинотерапии зарегистрировано не было [26].

В свете упомянутых данных представляется важным то, что Т-вакцинация может быть эффективным методом лечения PC не только на ранних, но и на относительно поздних стадиях заболевания. Длительная ремиссия в форме стабилизации неврологических параметров может быть достигнута у значительной части пациентов с прогрессивной формой PC.

В последнее время большое внимание уделяется исследованию возможности применения в лечении PC вакцинации пептидами ТКР. Установлено, что индуцированные Т-клеточной вакцинацией антиидиотипические Т-клетки преимущественно распознают идиотипические пептидные детерминанты, локализованные в CD3 или CD2 регионе ТКР [3]. Возможность получения иммунодоминантных пептидов синтетическим путем позволила подойти к получению и использованию бесклеточной вакцины. Данные о применении пептидной вакцины в лечении PC были впервые опубликованы в 2001 г. [27]. В исследование было включено 10 пациентов. В качестве вакцинирующего агента использовали пептид BV6S2/6S5, локализованный в CD2 регионе бета-цепи ТКР. Перед инъекцией пептид эмульгировали в неполном адъюванте Фрейнда. В результате выполненного исследования было установлено, что пептидная вакцинация способна индуцировать антиидиотипический T-клеточный ответ. Серьезных побочных эффектов такой вакцинации не отмечено.

Поскольку аутоиммунный процесс, приводящий к демиелинизации нервной ткани, в большинстве случаев является олиго- или поликлональным, было предложено использовать для вакцинации несколько пептидов, наиболее часто встречающихся в структуре ТКР миелинреактивных Т-клеток. Опубликованы данные об использовании в лечении PC вакцины, состоящей из 3 пептидов BV5S2, BV6S5 и BV13S1. В исследование было включено 23 пациента с разным течением заболевания. Перед инъекцией вакцинальные пептиды были эмульгированы в неполном адъюванте Фрейнда. Каждый пациент получил 12 ежемесячных вакцинаций. Установлено, что такая вакцинотерапия была эффективна в индукции устойчивого антиидиотипического иммунного ответа [28]. После 3-4 инъекций в крови большинства вакцинированных пациентов было отмечено увеличение количества индуцированных CD4⁺ клеток, продуцирующих ИЛ-10. Вакцинация также приводила к устойчивому повышению экспрессии белка FoxP3 как в индуцибельных (CD4⁺ CD259, так и естественных (CD4⁺ CD25⁺) Трег [29]. Таким образом, подобно клеточной вакцинации, пептидная вакцинация потенциально способна индуцировать устойчивый антиидиотипический иммунный ответ, направленный на торможение развития аутоиммунного процесса.

Механизм негативного влияния Т-клеточной вакцинации на аутоиммунный процесс

Установлено, что Т-клеточная вакцинация способна элиминировать из организма аутоиммунные клетки [20—22]. Этот эффект связывают с функциональной активностью индуцированных вакцинацией антиидиотипических CD8⁺ Т-клеток. Показано, что эти клетки способны распознавать идиотипические детерминанты в комплексе с антигенами главного комплекса гистосовместимости I класса и оказывать прямой литический эффект на вакцинальные Т-лимфоциты [22, 20]. Такое распознавание является высокоспецифичным и направлено преимущественно на детерминанты, локализованные в районе CD3 ТКР [30]. Т-клеточная вакцинация также индуцирует генерацию антиидиотипических CD4⁺ Т-клеток. Эти клетки способны распознавать идиотипические детерминанты в комплексе с антигенами главного комплекса гистосовместимости II класса. Они могут принадлежать к разным типам регуляторных клеток: Тх 2 [продуценты ИЛ-4]; Тх 3 [продуценты трансформирующего ростового фактора-бета); и Тр1 (продуценты ИЛ-10).

Т-клеточная вакцинация также затрагивает функцию естественных CD4⁺CD25⁺ Трег. Имеются данные о том, что часть этих клеток обладает специфичностью к ТКР и исходно вовлечена в идиотип-антиидиотипическую иммунорегуляцию Это означает, что Т-клеточная вакцинация может создавать благоприятные условия для экспансии CD4⁺CD25⁺Tpen, специфичных к вакцинальным ТКР [31]. Естественные Трег, по-видимому, ответственны за антиэрготипическую регуляцию Т-клеточных реакций, которая не связана с иммунным распознаванием идиотипических детерминант. У пациентов, вакцинированных облученными аутогенными Т-лимфоцитами, были обнаружены и охарактеризованы CD4⁺CD25⁺Tper, специфично реагирующие на синтетический пептид, соответствующий аминокислотной последовательности 61-73 альфа-цепи рецептора к ИЛ-2. Независимо от своей антигенной специфичности, Трег реагируют только на активированные, а не на покоящиеся Т-кпетки [32]. Индуцируемые T-клеточной вакцинацией иммунные Т-взаимодействия затрагивают разные по своему назначению субпопуляции Т-лимфоцитов. В частности, показано, что такая вакцинация может приводить к генерации гамма-дельта Т-лимфоцитов, которые в активированном состоянии продуцируют ИЛ-2, ФНО-α и ИЛ-10 [33]. Уже после нескольких Т-клеточных вакцинаций в сыворотках большинства пациентов отмечается существенное увеличение концентраций ИЛ-4 и ИЛ-10 на фоне неизменных концентраций ФНО-α, и ИФ-γ [34]. Этот факт может свидетельствовать о том, что в суммарном итоге Т-клеточная вакцинация индуцирует иммунологический сдвиг в сторону доминирования Тх2 реакций.

Т-клеточная вакцинация индуцирует не только Т-, но и В-клеточные реакции. Вакцинация миелин-реактивными Т-лимфоцитами приводит к повышению количества в организме В-лимфоцитов, продуцирующих антиидиотипические антитела, специфичные к ТКР вакцинальных клеток. Эти антитела преимущественно распознают детерминанты, локализованные в CD3 регионе. Они способны ингибировать пролиферацию и функциональную активность миелин-реактивных Т-клеток. Этот эффект не отменяется в присутствии антител к продуктам главного комплекса гистосовместимости. Это означает, что антиидиотипические антитела распознают интактные ТКР детерминанты, не комплексированные с молекулами главного комплекса гистосовместимости [35]. Механизм действия таких антител может быть связан с экранированием и функциональной блокадой ТКР [36].

Таким образом, механизм влияния Т-клеточной вакцинации на аутоиммунный процесс включает в себя 4 основных компонента: 1) генерацию антиидиотипических цитотоксических CD8⁺ Т-лимфоцитов; 2) генерацию антиидиотипических CD4⁺Tx2 и ТхЗ; 3) индукцию и стимуляцию функциональной активности Трег; 4) индукцию синтеза антиидиотипических антител. Т-клеточная вакцинация потенциально способна включать механизм иммунной памяти, а это означает, что ее эффект на аутоиммунный процесс может быть высокоспецифичным и долговременным.

Т-клеточная вакцинация в лечении пациентов с рассеянным склерозом

Получение Т-клеточной вакцины — это трудоемкая, лабораторная технология, направленная на лечение отдельного пациента. Возможность повсеместного внедрения этого метода в лечение PC представляется маловероятной. Использование для вакцинации ТКР пептидов представляется более выигрышным подходом в этом отношении. Следует, однако, иметь в виду, что иммунная аутоагрессия, приводящая к демиелинизации нервной ткани, может быть направлена против разных антигенов и, что в большинстве случаев, развитие PC является следствием поликлональной активации аутоиммунных лимфоцитов. Кроме того, значимость того или иного аутоантигена в развитии заболевания может быть подвержена существенным индивидуальным вариациям. Поэтому подбор универсального комплекса вакцинальных ТКР пептидов, эффективных в лечении PC, может стать для исследователей неразрешимой задачей.

Наши собственные данные свидетельствуют, что после курса иммунотерапии, состоящей из нескольких вакцинаций, индуцированная антиидиотипическая Т-кпеточная реактивность постепенно затухает и через 8—10 мес. приближается к неопределяемому уровню [25]. Эти данные указывают на целесообразность проведения долговременной поддерживающей вакцинотерапии.

Согласно опубликованным данным [29], у части вакцинированных пациентов после периода стабилизации наблюдается тенденция к ускоренной прогрессии заболевания. Этот феномен объясняется появлением новых аутоиммунных клонов, идиотипические детерминанты которых оказались вне поля действия индуцированных вакциной антиидиотипических лимфоцитов. Логично полагать, что вакцинация пациента именно этими клонами могла бы продлить период стабилизации.

В свете вышесказанного мы полагаем, что в лечении PC Т-клеточная вакцинация имеет и будет иметь преимущества перед пептидной вакцинацией. Поскольку при PC аутоиммунный процесс может быть направлен на разные антигенные детерминанты, поликлональная Т-клеточная вакцина, генерированная в присутствии комплекса миелиновых антигенов, может быть более эффективна в лечении PC в сравнении с моноклональной или олигоклональной вакциной. Для поддержания эффективного антиидиотипического иммунного ответа целесообразно проводить поддерживающую вакцинотерапию, периодически используя для этого вновь приготовленную вакцину.

Об авторах

Галина Викторовна Селедцова

ГУ НИИ Клинической иммунологии СО РАМН

Автор, ответственный за переписку.
Email: vs@online.nsk.su

Laboratory of Cellular Biotechnologies

Россия, Новосибирск

Ирина Петровна Иванова

ГУ НИИ Клинической иммунологии СО РАМН

Email: vs@online.nsk.su

Laboratory of Cellular Biotechnologies

Россия, Новосибирск

Виктор Иванович Селедцов

Российский государственный университет им. Э. Канта

Email: vs@online.nsk.su

Department of Medicine

Россия, Калининград

Список литературы

Дополнительные файлы