Improving the method of cloning primate embryos

Full Text

За время развития технологии переноса ядра соматической клетки (ПЯСК) только в марте 2004 года были опубликованы первые результаты по успешному созданию полноценных бластоцист человека и выделению из них линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) [1].

Вероятность рождения жизнеспособного потомства после ПЯСК остаётся крайне низкой, но приближается к 1-3% у некоторых видов успешно клонированных животных [2]. Все заявления о клонировании человека на сегодняшний день в научном обществе считаются фикцией [3]. Идея о возможности клонирования приматов может максимально приблизить человечество к возможности клонирования человека как вида и усовершенствования технологии ПЯСК для клеточной терапии и создания индивидуальных банков ЭСК. Приматы могут послужить «про-человеческой» моделью для изучения механизмов репрограммирования ядра соматической клетки, влияния эпигенетических факторов, цитоплазматического наследования, биологии ЭСК, условий оптимального развития эмбрионов до имплантации и после нее.

Первые клонированные приматы были получены методом переноса ядра эмбриональной клетки (бластомеров) несколько лет назад [4, 5] (рис. 1). Все предшествующие попытки клонировать обезьян методом ПЯСК были безуспешны. Только 2 года назад удалось получить бластоцисту приматов при ПЯСК с общей вероятностью успеха < 1% [7]. В 2003 году группа Simerly С. сообщила о серьёзных проблемах, связанных с нарушениями расхождения хромосом при делении яйцеклетки приматов после ПЯСК в метафазе II [6] (рис. 2). Группа Hwang Y.J. [1] предложила несколько модификаций протокола ПЯСК, которые привели к успешному созданию человеческих бластоцист. В частности, было предложено производить более мягкое извлечение комплекса хромосомного веретена, энуклеацию до остановки яйцеклетки в метафазе II и некоторые новшества в культуре [1].

Рис. 1. Бластоциста примата, полученная методом переноса ядра соматической клетки. Из Dev Biol 2004; 276; 2: 237-52 с изменениями.

Рис. 2. Аномалии развития микротрубочек хромосомного веретена деления при внутривидовом ПЯСК (а). Нормальная картина при внутривидовом переносе ядра клетки примата в ооцит телёнка (б). Окраска микротрубочек (зелёный) и ДНК ядра (синий). Из Dev Biol 2004; 276; 2: 237-52 с изменениями.

Рис. 3. Картина аномального первого митоза в эмбрионе примата, созданного методом ПЯСК (а). Нормальная метафаза (б) и телофаза (в) митоза контрольного партеногенетически развитого эмбриона. Окраска микротрубочек (красный), ядра (синий) и белка Eg5 центросом (зелёный). Из Dev Biol 2004; 276; 2: 237-52 с изменениями.

В недавней работе, опубликованной в Developmental Biology группа Simerly С. успешно применила инновационную технологию Hwang для решения проблем, связанных с развитием предимплантационных эмбрионов приматов после ПЯСК. Энуклеацию яйцеклеток производили по методу Hwang в пре-метафазе II. Ядра выделяли из аутологичных кумулюсных клеток и аллогенных - линии кожных фибробластов приматов (после 2-4 пассажей). Для контроля производили также перенос ядер клеток бластомеров, выделенных из 16-32-клеточных эмбрионов. Активацию и культивирование эмбрионов выполняли по описанным ранее протоколам. После 4-х дней культивирования бластоцисты переносили в матку суррогатной матери. С помощью микроскопической техники вели прижизненное наблюдение за эмбрионами. Наилучших результатов добились при использовании протокола электрослияния с одновременной активацией. Так, при переносе аллогенных ядер фибробластов получали жизнеспособные бластоцисты в 43% попыток из удачно слившихся. При переносе ядер фибробластов получали эмбрионы с нормальным кариотипом. Однако, при переносе ядер аутологичных кумулюсных клеток не удалось получить ни одной бластоцисты (и только 1 морулу) при использовании 3-х различных протоколов активации. Наблюдали несколько ускоренное развитие эмбриона in vitro по сравнению с оплодотворёнными яйцеклетками. Хорошая внутренняя клеточная масса обнаруживалась только в двух из 4-х полученных бластоцист. ЭСК, выделенные из этих бластоцист, прекращали рост в культуре через неделю. Из 135 переносов эмбрионов в матку суррогатной матери (n=25) ни один не завершился развитием беременности. В контроле же - перенос эмбрионов (147 эмбрионов 41 реципиенту), оплодотворённых in vitro, в - 14,6% случаев приводили к развитию беременности. Несмотря на кажущуюся нормальную морфологию ранних эмбрионов, многие ядра быстро развивали анеуплоидию и дезаггрегацию ДНК, уже в телофазе первого митоза. Нарушалось расхождение хромосом и веретена деления, что подтвердило прошлогодние данные этой же группы [6]. Нарушения деления были выявлены на уровне 4-х, 8-ми и т.д. клеточных стадиях. Аналогичные нарушения в предимплантационных эмбрионах наблюдали при переносе ядер эмбриональных клеток. Все эти нарушения приводили к быстрой остановке развития эмбриона. В контрольных, партеногенетически развитых эмбрионах, не обнаруживались никакие нарушения аппарата деления. При детальном изучении оказалось, что центросомы при ПЯСК не могут «собирать» микротрубочки веретена деления, в отличие от переноса ядра эмбриональной клетки, где эта сборка не нарушена. Если яйцеклетки химеризовать посредством ПЯСК в сочетании с фертилизацией (которая, собственно, и послужит сигналом к активации деления), то наблюдается успешное начало синтеза ДНК и процесса деления. При межвидовом переносе ядра клеток телёнка в яйцеклетку приматов не было никаких проблем с инициацией процесса деления. При ПЯСК приматов в телячью яйцеклетку наблюдали более благоприятное развитие «фигур деления» по сравнению внутривидовым переносом. При переносе ДНК сперматозоида в энуклеированную яйцеклетку в 80% наблюдений не обнаруживали каких-либо нарушений инициации и первых делений. Тем не менее, при последующих делениях вновь наблюдали хромосомные дефекты, и только в 24% наблюдений удавалось получить абсолютно нормальные 8-ми-клеточные эмбрионы. Наконец, было установлено, что дисфункция формирования митотического веретена связана с недостаточностью специфических белков -NuMA, HSET и Eg5.

Таким образом, приматы являются одним из самых трудных объектов для клонирования. Для нормального развития раннего эмбриона приматов необходимо наличие центросом сперматозоида и комплекса мейотического веретена яйцеклетки. При клонировании других видов животных центросомы привносятся с ядром донорской клетки (крупный рогатый скот) или локализованы в ооплазме (мыши). При ПЯСК в энуклеированную яйцеклетку примата центросомы оказываются «бездействующими», и наблюдается недостаточность белков, ответственных за правильное построение хромосомного веретена деления. Дефекты построения хромосомного веретена деления в интерфазе и при первом митозе являются решающими для дальнейшего неблагоприятного развития эмбрионов. Работа подтвердила жизнеспособность методики ПЯСК Hwang и показала перспективность её применения при будущих попытках клонирования новых видов и создания линий ЭСК. Исследователи установили причины неудачных попыток создания жизнеспособных эмбрионов приматов и разработали оптимальные методы получения бластоцист, готовых для выделения ЭСК или имплантации в матку с последующим созданием клона. Распознавание механизмов развитияэмбриона после ПЯСК может иметь значение для изучения цитоплазматического наследования и причин развития дефектов в постимплантационном периоде и после рождения жизнеспособных клонов. Только 20% клонированных бластоцист (и 50% бластоцист, полученных путём оплодотворения) приматов имеет хорошую внутреннюю клеточную массу, из которой можно выделить жизнеспособные линии ЭСК. Тем не менее, именно эти технологии можно использовать для выделения иммуносовместимых ЭСК для клеточной терапии. До сих пор так и не удалось получить постимплантационный жизнеспособный эмбрион приматов методом клонирования. Все попытки переноса бластоцист в матку не заканчивались беременностью. Можно предположить, что аналогичные проблемы будут возникать и при попытках репродуктивного клонирования человека.

About the authors

A. V. Bersenev

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Primate blastocyst obtained by somatic cell nuclear transfer. From Dev Biol 2004; 276; 2:237-52, as amended.

Download (25KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Anomalies in the development of microtubules of the chromosomal spindle in case of intraspecific PID (a). Normal picture during intraspecific transfer of a primate cell nucleus into a calf oocyte (b). Staining of microtubules (green) and nuclear DNA (blue). From Dev Biol 2004; 276; 2:237-52, as amended.

Download (56KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Pattern of abnormal first mitosis in a primate embryo, created by the PNS method (a). Normal metaphase (b) and telophase (c) of mitosis of a control parthenogenetically developed embryo. Staining of microtubules (red), nucleus (blue) and protein Eg5 centrosomes (green). From Dev Biol 2004; 276; 2:237-52, as amended.

Download (33KB)

Indexing metadata