Perspectives of bone marrow stromal cell transplantation for the treatment of cystic fibrosis

Full Text

Муковисцидоз (МВ) - одно из распространённых (среди представителей европейской расы) аутосомно-рецессивное наследственное заболевание, возникающее в результате мутации гена CFTR (transmembrane conductance regulator), регулирующего транспорт иона хлора через мембрану эпителиальной клетки. При этом усиливается абсорбция натрия и воды, и происходит «высушивание» слизи, продуцируемой экзокринными железами. Избыточно вязкий секрет закупоривает протоки, вследствие чего образуются множественные кисты и развивается системная дисфункция экзокринных желёз. МВ является актуальным в структуре заболеваемости и смертности (основной причиной которой является прогрессирующая дыхательная недостаточность и присоединение инфекций) среди детей и подростков [1].

За последние несколько лет было предложено несколько протоколов генотерапии МВ, использующей генетические конструкции CFTR [2-4]. Оптимальной терапевтической мишенью для доставки вектора с CFTR считается дыхательный эпителий (ДЭ), однако его трансфекции in vivo препятствуют избыток слизи, отсутствие рецептора для вируса на поверхности клетки, быстрая деградация ДНК и плохая интеграция вектора [2-4]. Альтернативный подход к заместительной клеточной генотерапии недавно был предложен группой Wang-Prockop. Он заключается в применении аутогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МСК), трансфецированных конструкцией CFTR, как потенциального источника нового (здорового) ДЭ. Подоплёкой к применению МСК для терапии МВ послужили следующие данные:

• указания на возможность дифференцировки (или слияния) МСК в эпителиальные клетки дыхательных путей in vitro и in vivo [5, 6, 8];
• хорошая миграция МСК в дефектные лёгкие in vivo [7, 8];
• неплохая трансфецируемость МСК различными генетическими конструкциями с уверенной экспрессией трансгена [9];
• возможность использования аутологичного материала и экспансия МСК in vitro в миллиард раз за 2 месяца культивирования [10, 11].

МСК забирали из крыла подвздошной кости от здоровых волонтёров и от больных МВ. Клетки выделяли и культивировали по протоколу Sekiya-Prokop [10] с масштабированием в системе клеточной фабрики (Nunc). Клетки модифицировали меткой GFP и трансгеном CFTR с последующей лекарственной селекцией. Для дифференцировки МСК применяли специальную систему кокультивирования с линией дефектного (по CFTR) ДЭ или с первичными клетками, выделенными из лёгких больных МВ. Клетки кокультивировали на границе раздела жидкой и газовой (воздушной) фаз. Через 2 (и более) недели кокультивирования нормальных МСК и дефектных клеток ДЭ в такой системе наблюдали появление эпителио-подобных клеток, несущих метку МСК. Кроме того, часть GFP+ (МСК) клеток положительно окрашивалась на эпителиальные маркёры - СК-18 и occludin (~ 10% МСК), чего не наблюдалось в контрольных экспериментах (культивирование МСК в сходных условиях). После кокультивирования наблюдали экспрессию CFTR дикого типа, что подтверждали методом RT-PCR отсортированных (FACS) GFP+ клеток. То есть, часть МСК от здоровых доноров при кокультивировании подвергалась трансдифференцировке в клетки ДЭ. Феномен слияния исключали отсутствием клеток, положительно окрашивающихся одновременно как по метке МСК - GFP, так и по метке ДЭ - RFP.

Для оценки клинического потенциала метода выделяли МСК от МВ - гомозигот. Клетки больных МВ имели одинаковую со здоровыми способность к экспансии in vitro и дифференцировке в ткани, имеющие мезенхимальное происхождение - костную и жировую. Дефектные МСК трансфецировали CFTR. Было показано, что генетическая коррекция МСК не влияла на их способность к делению, образованию колоний и способности к дифференцировке (по сравнению клетками до трансфекции и нормальными МСК от здоровых доноров). Устойчивость экспрессии CFTR подтверждали методом RT-PCR. Наконец, при кокультивировании дефектных, трансфецированных CFTR МСК (от больных МВ) с дефектной линией ДЭ через месяц наблюдали восстановление секреции аниона хлора (по радиоактивной метке). Как и в физиологических условиях, хлор секретировался с апикальной части мембраны клеток в ответ на стимуляцию c AMP. Секреция хлора не зависела от количества МСК (5, 10 или 20%) при ко- культивирвании с дефектными клетками ДЭ. Оптимальное соотношение кокультуры 1:5 (20% МСК).

Таким образом, предложен новый оригинальный метод клеточно-генетической коррекции функции ДЭ у больных МВ. Исследование, проведенное на материале пациентов с МВ, продемонстрировало возможность использования аутологичных ген-модифицированных (или немодифициро- ванных) МСК в клинической практике. Однако до начала клинических испытаний необходимо подтвердить эффективность метода на животных моделях.

About the authors

A. V. Bersenev

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files