Plasticity of bone marrow stem cells: involvement of Flk-1+ cells in skin chimerization and differentiation

Full Text

Степень пластичности мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МСК) продолжает широко обсуждаться в научных кругах. Ряд работ посвящён изучению возможности дифференцировки клеток костного мозга в клетки кожи с перспективами их использования в лечении дефектов этого органа. Классическими работами по этой тематике являются исследования групп Krause и Korbling. Авторы получили ряд интересных фактов, свидетельствующих о возможном участии МСК в репарации кожного эпителия. Так, Korbling обнаружил Y+ клетки, экспрессирующие цитокератины в базальном слое кожного эпителия после трансгендерной пересадки гемопоэтических стволовых клеток человеку с частотой ~ 2-7% [1]. В работе Krause на мышиной модели, были обнаружены подобные клетки с частотой встречаемости 1,2 - 2,7% [2]. Однако, в исследовании Hematti не было получено подобной химеризации кожи, несмотря на применение высокочувствительных методов (RT-PCR), что могло бы поставить под сомнение результаты предыдущих работ [3]. В опытах по трансплантации GFP+ костного мозга диким мышам-реципиентам с моделью повреждения кожи было показано, что значительное число клеток мигрирует как в поврежденные, так и в неповрежденные участки кожи. Повреждение стимулировало приживление и дифференцировку клеток костного мозга в коже [4, 7]. Недавно было показано, что усиление миграции клеток костного мозга в области кожного дефекта, и их дифференцировка в элементы эпидермиса не обусловлена феноменом слияния [5]. В другом эксперименте повреждение усиливало включение клеток костного мозга с уровня менее чем 1% до 4%, но явления дифференцировки в цитокератин-позитивные клетки были настолько редки, что исследователи ставят под сомнение степень пластичности донорских клеток [6]. Таким образом, предшествующие эксперименты по трансплантации фракционированного костного мозга продемонстрировали способность к миграции и химеризации кожи (как повреждённой, так и здоровой) и указали на возможную способность к дифференцировке в её отдельные структуры. Однако неясно, какие именно клетки и сигналы обуславливают способность к химеризации кожи, дифференцировке и стимуляции заживления ран.

Серия работ по местному применению пластик-адгезивной фракции костного мозга (называемой исследователями мезенхимальными стволовыми клетками - МСК), продемонстрировала, что в ране ускоряется образование грануляционной ткани и инициируется процесс регенерации. Раневое микроокружение индуцировало пролиферацию МСК и вызывало усиление синтеза коллагена [8-10]. Другим возможным механизмом заживления является дифференцировка клеток костного мозга в фибробласты в зоне дефекта и синтез ими белков экстрацеллюлярного матрикса [8]. В журнале Tissue Engineering опубликовано исследование китайских ученых, демонстрирующее способность отдельной фракции костного мозга (МСК) химеризовать кожу после внутривенной трансплантации на мышиной модели. Предшествующая работа этой группы [15] продемонстрировала, что Sca-1-/Flk-1+ клетки костного мозга мышей хорошо делятся в пластик-адгезивной культуре и не несут гемопоэтических маркёров, обладая «культуральным» сходством с МСК. В экспериментальной модели использовали самцов белых мышей (BALB/c, H-2Kd) и самок черных мышей (C57BL/6, H-2Kb). У самцов белых мышей был получен костный мозг, из которого с помощью магнитной сортировки выделены МСК с фенотипом CD45-/Ter119- /Flk-1+. Клетки были размножены в культуре в течение 2-4 недель. После культивирования они экспрессировали CD13, Cd29, CD44 и были негативны по CD34. Для полного исключения контаминации гемопоэтическими клетками производили удаление Sca-1+, в результате чего чистота культуры перед трансплантацией составила 91,57% Flk-1+. В качестве клеточной метки использовали красный трейсер CM-DiI.

Самки черных мышей были облучены в летальной дозе, после чего им производили внутривенную трансгендерную трансплантацию полученной культуры клеток в количестве 10 млн. Через 20 дней после трансплантации у черных самок-реципиентов стали появляться белые волосы с начальной плотностью 1 на 0,5 кв.см., с последующим увеличением их числа и плотности к 40 дню (рис.). После вывода животных из эксперимента исследовали участки кожи, несущие белые волосы. При флюоресцентной микроскопии было выявлено, что меченые трейсером клетки (Dil+) располагались в базальном слое эпидермиса и в волосяных фолликулах. Иммуногистохимическим методом была показана экспрессия этими клетками донорского антигена (H- 2Kd). Их донорское происхождение также было подтверждено наличием Y хромосомы (RT-PCR). Почти все донорские клетки локализовались в волосяных фолликулах белых волос, т.е. дифференцировались в придатки кожи. Исследование экспрессии одного из важнейших транскрипционных факторов стволовых клеток эпидермиса - p63, выявило три различные субпопуляции: H-2Kd+/p63+ - стволовые клетки донорского происхождения, H-2Kd+/p63-зрелые клетки кожи донорского происхождения и H-2Kd-/p63+ - собственные стволовые клетки реципиента. В контрольной группе с трансплантацией Sca-1+ гемопоэтических клеток по аналогичной схеме не было получено подобной химеризации кожи. Исследователи также исключили возможное изменение окраски волос под влиянием облучения. Выполненная по этой же схеме пересадка МСК костного мозга самцов черных мышей белым самкам не приводила к появлению черных волос даже через 3 мес., несмотря на то что пересаженные клетки обнаруживали, но существенно реже.

Это исследование выгодно отличается от предшествующих работ тем, что авторы экспериментировали с чётко определённой стволовой фракцией костного мозга - Flk- 1+ клетками. Впервые была получена очень высокая степень химеризации кожи донора (без её повреждения) при внутривенном введении клеток. Предыдущие исследования не могли ответить, какая именно популяция клеток костного мозга способна к высокому химеризму и дифференцировке в элементы кожи как органа-мишени. Интересно, что большая часть клеток донора локализовалась в волосяных фолликулах и дифференцировалась в придатки кожи - волосы. Известно, что волосяной фолликул содержит один из основных стволовых компартментов кожи, поэтому возникает вопрос о слиянии стволовых клеток между собой как об основном механизме химерной дифференцировки. Набор методов, примененный исследователями, выявил наличие нескольких популяций клеток, возникающих не в результате слияния, однако этот феномен полностью не исключен.

Таким образом, клеточной популяцией костного мозга, способной к миграции, высокой степени химеризма и дифференцировке в клетки кожи, следует считать Flk-1+ клетки. Однако, выбор именно этого маркёра остаётся дискуссионным. Flk-1 является одним из рецепторов (тирозин-киназовым) сосудистого фактора роста эндотелия (vascular endothelial growth factor - VEGF) [11, 12]. Он экспрессируется, преимущественно на эндотелиоцитах и гемопоэтических прогениторных клетках [12]. Сортировка клеток (эмбриональных стволовых [13] и костного мозга взрослых и фетусов [14]) по Flk-1+ производится, как правило, для получения предшественников сосудистого эндотелия и стимуляции ангиогенеза. Некоторые исследователи относят Flk-1+ к маркёрам МСК, поскольку эти клетки не коэкспрессируют гемопоэтических маркёров (что подтверждают авторы данного исследования) и обладают выраженными адгезивными и пролиферативными свойствами в культуре [15, 16]. Однако Flk-1+ клетки, выделенные из эмбриональных стволовых клеток, способны к восстановлению гемопоэза у SCID-мышей [17]. Таким образом, на сегодняшний день, установлено участие Flk-1+ популяции клеток в гемопоэзе, ангиогенезе и регенерации кожи. Возможно, что Flk-1+ клеточная популяция является одним из кандидатов на более ранний стволовой мультипотентный компартмент костного мозга (мышей) [14].

About the authors

A. V. Volkov

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files