Isolation and culturing of chondrocytes from different sources

Full Text

Введение

Лечение заболеваний и травм опорно-двигательного аппарата остается актуальной проблемой современной медицины. Несмотря на способность к репарации, костная и хрящевая ткани иногда не в состоянии полностью устранить дефицит, возникший в результате действия повреждающего фактора. Попытки восстановить утраченную часть кости или хряща предпринимались с давних пор и сводились, прежде всего, к аллотрансплантации кусочков ткани или использованию синтетических материалов [1]. Однако у этих широко применяемых и ставших уже рутинными технологий есть множество недостатков от наличия иммунологического барьера и дефицита пластического материала до остаточного ограничения качества жизни, даже после проведенного лечения синтетические протезы). Развитие клеточной биологии и, в частности, исследований в области тканевой инженерии открывают новые перспективы в реконструктивной ортопедии [2, 3]. Как известно, клеточная технология позволяет, не меняя поврежденный орган, «обновлять» его клеточный состав [4]. Поэтому подбор оптимальных условий получения и культивирования хондроцитов представляется актуальной задачей.

Целью данного исследования явилась отработка условий получения и культивирования клеток хрящевых тканей, полученных из различных источников.

Материал и методы

В работе использовали хрящевую ткань фетусов человека, хрящевую ткань позвоночника больных идиопатическим сколиозом, а также хрящевую ткань межпозвонковых дисков новорожденной собаки. Хрящевую ткань позвоночника больных идиопатическим сколиозом после проведения плановых операций, а также хрящевую ткань межпозвонковых дисков новорожденной собаки, получали из научно-исследовательского института травматологии и ортопедии г. Новосибирска.

Выделение хондроцитов из хрящевой ткани проводили механо-ферментативным методом, используя в качестве диспергента коллагеназу IV типа (MР Biomedicals) в концентрациях 0,05%, 0,1%, 0,15%, трипсин (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) в концентрации 0,025%, гиалуронидазу I-S типа (Sigma-Aldrich) в концентрации 0,05% и сочетание ферментов коллагеназы и гиалуронидазы в концентрации по 0,05% каждого. Хрящевую ткань, очищенную от окружающих мягких тканей, измельчали до кусочков размером 1-3 мм², затем обрабатывали ферментом фетальную ткань в течение 5-8 часов и 18-20 часов хрящевую ткань позвоночника больных идиопатическим сколиозом при постоянном помешивании при температуре 37°С. После ферментации полученную взвесь клеток пропускали через нейлоновый фильтр и отмывали 2 раза от раствора диспергента питательной средой, затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин. Процент жизнеспособных хондроцитов подсчитывали с помощью трипанового синего [5].

Индекс пролиферации культуры определяли при каждом пассаже [6, 7].

Клетки культивировали с использованием среды DMEM/F12 (Биолот, Санкт-Петербург) с добавлением 20% сыворотки крови плодов коровы (Биолот, Санкт-Петербург). Клетки с поверхности культурального флакона снимали с помощью смеси растворов 0,02% Версена (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) и 0,025% трипсина (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) в соотношении 5:1. Пассирование проводили 2 раза в неделю [6, 7].

Морфологию культур клеток оценивали с помощью инвертированного микроскопа «Carl Zeiss Jena».

Криоконсервацию проводили ступенчатым методом погружения в жидкий азот с помощью внутриклеточного криопротектора DMSO (MР Biomedicals) в концентрации 10% [6, 7].

Для статистической обработки данных использовали метод достоверности различий между группами по критерию Стьюдента [t] с определением показателя статистической достоверности [при р<0,05 различия рассматривались как статистически достоверные].

Результаты исследования и обсуждение

При получении первичных культур клеток одним из важных моментов является подбор протеолитических ферментов. Хрящевые ткани в зависимости от возраста и вида источника требуют разного способа выделения клеток. Для получения первичных культур клеток используется целый ряд дезагрегирующих ферментов и реагентов: трипсин, химотрипсин, коллагеназа, тринатрий цитрат, смесь версена и трипсина и др. Следует отметить, что, несмотря на многообразие предлагаемых ферментов, наиболее распространенными на сегодняшний день является использование трипсина и коллагеназы [8].

Для получения суспензии хондроцитов использовали кусочки хрящей из межпозвонковых дисков новорожденной собаки, которые диссоциировали с помощью растворов 0,025% трипсина или 0,1% коллагеназы (n = 4). Результаты показали, что при использовании растворов трипсина остается большое количество кусочков недиссоциированной ткани, а увеличение времени воздействия трипсина приводило к гибели клеток. Применение же растворов коллагеназы позволяло получить суспензию клеток с жизнеспособностью более 90%.

Анализ литературных данных показал, что не существует универсальной методики выделения хондроцитов. В работах использовали различные диспергенты: коллагеназу, гиалуронидазу, проназу и др. [9-13]. В нашей работе мы сравнили способы выделения хондроцитов с помощью растворов коллагеназы и гиалуронидазы (n = 6). Данные по выделению жизнеспособных клеток в зависимости от вида и концентрации ферментов представлены на рис. 1.

Рис. 1. Количество выделенных жизнеспособных клеток в зависимости от вида и концентрации фермента

Как видно из рисунка, при использовании 0,05 % гиалуронидазы количество жизнеспособных хондроцитов составило 10 млн/г ткани. В то же время использование 0,05% коллагеназы приводило к увеличению количества выделенных клеток приблизительно в 2 раза. Количество жизнеспособных хондроцитов при использовании 0,1% коллагеназы или смеси гиалуронидазы и коллагеназы в концентрации по 0,05% каждой было сравнимо с таковым при использовании 0,05% коллагеназы. Наибольшее количество выделенных клеток в данном исследовании наблюдали при использовании 0,15% коллагеназы. Количество жизнеспособных клеток составило более 30 млн/г ткани.

Сравнительное исследование особенностей диссоциации хрящевой ткани фетуса и хрящевой ткани позвоночника больных идиопатическим сколиозом показало, что эти ткани требуют разного времени ферментативной диссоциации (n = 6). Хрящевая фетальная ткань человека и межпозвонковых дисков собаки диссоциировала в коллагеназе 5-8 часов, а хрящевая ткань позвоночника больных идиопатическим сколиозом 18-20 часов. Увеличение времени воздействия фермента приводило к гибели жизнеспособных хондроцитов, а уменьшение к снижению выхода клеток.

При культивировании хондроцитов из разных источников получения было отмечено различие морфологических и культуральных свойств клеток каждого источника.

Хондроциты фетальной хрящевой ткани прикреплялись и распластывались на поверхности культурального флакона на 2 час культивирования. В первые сутки можно было различить очаги роста, содержащие эпителиоподобные клетки. На 3 сутки культивирования хондроциты фетуса человека 1 пассажа формировали плотный монослой. При этом клетки имели специфическую эпителиоподобную морфологию (рис. 2А). К 3 пассажу культура хондроцитов приобретала фибробластоподобную форму (рис. 2В, С), что соответствует литературным данным [14]. Важно отметить, что культура хондроцитов суставов фетуса человека к 4 пассажу содержала больше фибробластоподобных клеток по сравнению с культурой хондроцитов позвоночника фетуса человека. На всем протяжении культивирования фетальные хондроциты показывали высокий уровень пролиферации, индексы пролиферации составили 4 и 5 на втором и третьем пассажах соответственно. При длительном культивировании индекс пролиферации снижался, в культуре наблюдали гибель клеток.

Рис. 2. Культура хондроцитов человека: А-культура хондроцитов позвоночника, 1 пассаж, 3 сутки культивирования; В-культура хондроцитов позвоночника, 4 пассаж, 3 сутки культивирования; С-кльтура хондроцитов суставов, 4 пассаж, 3 сутки культивирования; D-культура хондроцитов из межпозвонковых дисков пациентов, страдающих сколиозом, 1 пассаж, 21 сутки культивирования. Ув.:x200

Хондроциты позвоночника больных идиопатическим сколиозом в отличие от хондроцитов фетальной ткани при культивировании только на 14 сутки прикреплялись ко дну культурального флакона и начинали делиться и к 21 суткам формировали неплотный, сетчатый монослой. Клетки имели многочисленные вакуоли, более крупные размеры, по сравнению с хондробластами здоровой ткани (рис. 2D). При пассировании хондроциты позвоночника больных идиопатическим сколиозом показывали низкий уровень пролиферации, индекс пролиферации не больше 2, к 6 пассажу культура полностью деградировала. Таким образом, хондроциты позвоночника больных идиопатическим сколиозом по сравнению с хондроцитами фетальной ткани обладали худшей культуральной активностью. Это может быть связано как с возрастом донора, так и с нарушением обменных процессов в хрящевой ткани больных идиопатическим сколиозом [15].

Клетки межпозвонковых дисков новорожденной собаки показывали ту же динамику культивирования, что и хондроциты фетальной ткани человека (рис. 3): ко 2 часу культивирования клетки прикреплялись и распластывались по поверхности культурального флакона, к 3 суткам формировали плотный монослой. Хондроциты межпозвонковых дисков новорожденной собаки, по сравнению с фетальными хондроцитами человека, обладали меньшими размерами, имели округлую или полигональную форму. На протяжении периода культивирования хондроциты межпозвонковых дисков новорожденной собаки так же, как и хондроциты фетуса человека, показывали высокий уровень пролиферации (рис. 4).

Рис. 3. Культура хондроцитов пластинки роста позвоночника новорожденной собаки, 2 пассаж, 3 сутки культивирования. Ув.:x200

Рис. 4. Зависимость индекса пролиферации культур хондробластов человека и хондробластов пластинки роста собаки от номера пассажа

Заключение

Таким образом, в результате исследования показано, что для получения максимального количества жизнеспособных хондроцитов наилучшим методом диссоциации хрящевой ткани из разных источников выделения является обработка 0,15% раствором коллагеназы для фетальной ткани в течение 5 часов, а для ткани позвоночника больных идиопатическим сколиозом в течение 18-20 часов.

Культуры хондроцитов, полученные из разных источников, отличаются друг от друга по культуральным и морфологическим свойствам. Наибольшей культуральной активностью обладают клетки, выделенные из хрящевой ткани фетуса человека.

Обнаруженные нами различия в морфологии и культуральной активности хондроцитов, выделенных из различных источников, в перспективе могут быть использованы при разработке способов воздействия на регенерацию суставного хряща или межпозвонковых дисков; наиболее перспективным материалом в этом плане следует признать фетальные хондроциты.

Комментарий

А.В. Волков

ГУ «НИИ морфологии человека» РАМН, научный сотрудник ЗАО «Реабилитационные медицинские технологии», старший научный сотрудник, руководитель отдела регенерации костной и хрящевой тканей

Член Международной ассоциации по тканевой инженерии и регенеративной медицине (TERMIS)

Одной из актуальных проблем современного здравоохранения остаются дегенеративные заболевания суставных хрящей. Современные подходы к лечению не обеспечивают стабильного терапевтического эффекта и часто приводят к необходимости оперативного лечения.

Стремление исследователей к поиску эффективных и малоинвазивных методов, позволяющих добиться регенерации хрящевой ткани, близкой к органотипической, привели к тому, что все чаще в зарубежной и отечественной литературе стали появляться работы, посвященные применению хрящевых клеток для восстановления хрящевой ткани. Трансплантация клеточной культуры в составе тканеинженерных конструкций перешла из экспериментальных исследований в клиническую практику.

Выполнение принципа аутогенности сопряжено с выбором адекватной донорской зоны источника клеточного материала, отвечающего следующим требованиям: малоинвазивность, техническая простота биопсии, минимальный риск осложнений, минимальный объем препарата должен содержать максимальное количество хондробластов, что требует создания четких протоколов получения и культивирования клеточного материала.

Основу протоколов выделения хондробластов из образцов ткани составляет применение ферментов, позволяющих произвести дезагрегацию внеклеточного матрикса с минимальным повреждением клеток. В литературе описаны методики выделения клеток с применением коллагеназ, проназ и трипсина. Однако абсолютного стандарта не существует. Каждый исследователь, принимая во внимание этот принцип, подбирает оптимальные условия. Поэтому, согласно зарубежным клиническим стандартам, от момента биопсии до выдачи трансплантата проходит не больше 4 недель.

Статья И.И. Ким, безусловно, актуальна. При отсутствии разработанных клеточных продуктов, в нашей стране имеется большое число потенциальных потребителей услуги восстановления костной или хрящевой тканей. Хотелось бы отметить, что, согласно международным требованиям, исследования такого рода следует проводить в общепринятом порядке: экспериментальный этап, включающий разработку преклинических in vitro-протоколов, подтверждение безопасности и эффективности метода, а затем после анализа полученных данных и получения обнадеживающих результатов следует приступать к клиническим исследованиям.

Экспериментальная часть работы, представленная в статье не отвечает требованиям разработки единого преклинического протокола выделения и культивирования клеток, поскольку автор сравнивает пролиферацию клеток собаки и человека. Остаётся не совсем понятно, с какими клетками работал автор, поскольку в статье не указан иммунофенотип клеточной культуры. Авторами сделан вывод о перспективности клинического применения фетальных хондроцитов, основываясь на более высокой «культуральной активности» этого вида материала. Однако, высокая скорость пролиферации клеток в культуре не является преимуществом, связанным с перспективами их клинического применения. Особенно это касается фетального материала. Кроме этических проблем, связанных с его получением, которые не следует недооценивать, он остается аллогенным, генетически небезопасным и имеющуюся высокую вероятность инфицирования реципиента вирусными заболеваниями, даже после проверки в условиях специализированной лаборатории. В работе также не представлены данные о количестве и качестве исходного материала, величине выборки на точку наблюдения, плотности посева на культуральные чашки, как один из ключевых моментов в определении скорости пролиферации. В данном контексте представленная работа не может считаться преклинической и не выявляет преимущественного источника хондроцитов для будущего применения в клинике. Кроме того, преклиническая работа требует систематизации и более глубокого изучения мирового опыта исследований в данном вопросе. Тем не менее, несомненен вклад автора статьи в разработку оптимальных методов (в частности, режимов ферментирования тканей) выделения хондроцитов из различных источников. Вероятно, данное исследование является предварительным и будет дополнено последующими работами, которые в совокупности смогут ответить на поставленные вопросы.

About the authors

I. I. Кym

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation, Novosibirsk, Кol'tsovo

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1

Download (83KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2

Download (203KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3

Download (53KB)

Indexing metadata

5. Fig. 4

Download (76KB)

Indexing metadata

6. Fig. 5

Download (16KB)

Indexing metadata