Isolation of multipotent progenitor cells from human fetal liver

Full Text

Трансплантация гепатоцитов или прогениторных клеток печени для лечения печёночной недостаточности является одним из самых востребованных направлений современной регенеративной медицины. Залогом успеха реализации этих подходов является понимание основных ступеней дифференцировки клеток-предшественников в функционирующие гепатоциты в процессе эмбрионального развития, а также их характеристика, выделение и размножение в культуре. У грызунов прогениторные клетки печени присутствуют в каналах Геринга [1, 2] и могут дифференцироватья как в гепатоциты, так и в эпителиальные клетки выстилки желчных протоков, но не способны пролиферировать в ответ на повреждение [3, 4].

К настоящему времени были успешно выделены и довольно хорошо описаны прогениторные клетки из фетальной печени и эпителиальные клетки из печени взрослых грызунов. Suzuki et al. [5] изолировали из фетальной печени мышей клетки с фенотипом c-met+/CD49F+/CD29+/CD45-/ CD R119-, которые были способны к дифференцировке в гепатоциты и клетки желчных протоков, а также в эпителиальные клетки поджелудочной железы. Однако выделение мультипотентных клеток из фетальной печени человека и создание их линий гораздо более сложны, и к настоящему времени не было получено постоянной линии таких клеток печени [6].

Недавно группа исследователей из Вашингтонского Университета [Seattle, USА) впервые выделила и описала новую популяцию клеток фетальной печени человека, способных дифференцироваться как в мезенхимальном направлении, так и формировать гепатоциты. Эти клетки были названы фетальными мультипотентными прогениторными клетками печени hFLMPC [hepatic Fetal Liver Multipotent Progenitor Cells).

hFLMPC были выделены из семи фетальных печеней человека [74-108 дни гестации), после чего поддерживались в первичной культуре в течение трёх месяцев. Далее от них получали клоны, которые культивировались ещё в течение шести месяцев [100 удвоений популяции, 20 пассажей). Фенотипически hFLMPC представляли собой мелкие клетки с небольшим количеством цитоплазмы, экспрессирующие весьма интересный набор маркёров. Так, hFLMPC были позитивны по CD34, CD90 [thy-1), c-kit и SSFА-4. Эти маркеры характерны для стволовых клеток крови и присутствуют также на клетках фетальной печени грызунов [7]. Также hFLMPC позитивны по эпителиальным маркерам, таким как PCАM, CК18 и CК19. CК18 и CК19, являющимися маркерами гепатоцитов и эпителиальных клеток желчных протоков соответственно. Интересно, что hFLMPC также позитивны по мезенхимальным маркерам CD44h и виментину, но негативны по другим характерным для мезенхимы поверхностным молекулам, включая CD105, CD73 и бSMА. Они негативны по гемопоэтическим маркерам CD45 и АC133, позитивны по характерному для гепатоцитов c-met, но не экспрессируют других гепато-специфичных маркеров, таких, как альбумин, a-фетопоэтин и транскрипционных факторов HNF1a, HNF3b и HNF4b. Таким образом, hFLMPC несут смешанный набор мезодермальных и энтодермальных маркеров.

Было установлено, что иммунофенотипические и морфологические характеристики, а также дифференцировочные потенциалы hFLMPC разных пассажей идентичны. Клетки в культурах после первого, пятого и двадцатого пассажей имели одинаковую длину теломеров хромосом и не демонстрировали никаких признаков клеточного старения или «ухода» в апоптоз. Когда исследователи попытались найти в фетальной печени предшественников hFLMPC, пометив различные субпопуляции печёночных клеток флуоресцентным белком GFP, выяснилось, что ни одна из полученных из них колоний hFLMPC не была позитивна по GFP. hFLMPC оказались совершенно независимой популяцией клеток фетальной печени, вряд ли связанной с дедифференцированными паренхимальными гепатоцитами или трансдифференцированными мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками костного мозга [MMCК). В различных условиях культивирования hFLMPC дифференцировались в гепатоциты и эпителиальные клетки желчных протоков, а также в адипоциты, хондроциты, остеоциты и эндотелиальные клетки, то есть вели себя одновременно как энтодермальные и мезенхимальные предшественники.

Чтобы определить способность hFLMPC функционировать как гепатоциты in vivo, их трансплантировали иммунотолерантным мышам. Через тридцать дней от начала эксперимента у всех животных в печени обнаруживался человеческий сывороточный альбумин. На гистологических срезах были видны крупные клетки, позитивные по человеческому альбумину [уровень репопуляции достигал 0,8-1,7%). Эти данные свидетельствуют о том, что hFLMPC могут дифференцироваться в функциональные гепатоциты и интегрироваться в печёночную паренхиму при повреждениях.

Таким образом, морфология, эпителиальные маркеры и способность спонтанно дифференцироваться в гепатоциты отличают hFLMPC от MMCК [в своей работе экспериментаторы использовали MMCК из фетальной печени в качестве контроля и показали, что они не способны давать начало гепатоцитам и эпителиальным клеткам желчных протоков). Они сохраняют свой пролиферативный и дифференцировочный потенциалы в течение более чем шести месяцев, и развиваются в гепатоциты in vivo, что позволяет предполагать в них возможный источник для репопуляции печени при повреждениях органа.

В настоящее время исследователи продолжают работу, изучая критические факторы пролиферации и дифференцировки в различных направлениях, а также оптимальные условия для поддержания культур hFLMPC в течение более долгого времени. Предполагается, что подобные клетки можно получать не только из фетальной печени, но и из фетальной поджелудочной железы и почек. hFLMPC могут стать не только важным терапевтическим средством, но и объектом фундаментальных исследований путей дифференцировки клеток печени.

About the authors

A. S. Grigoryan

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation

References

Supplementary files