Primenenie CRISPR-oposredovannoy transkriptsionnoy aktivatsii s tsel'yu sozdaniya kletochnykh test-sistem dlya razrabotki i proverki metodov gennoy terapii nasledstvennykh zabolevaniy myshechnoy tkani

Full Text

Мышечные дистрофии характеризуются первичным поражением мышечной ткани, развивающимся непре-рывно-прогредиентно, зачастую приводя к инвалидности в трудоспособном возрасте, а также к смерти в детском и подростковом возрасте. Общая распространенность мышечных дистрофий составляет 19.8-25.1:100000, высоко распространена группа поясно-конечност-ных мышечных дистрофий (от 1:14500 до 1:123000). Этиотропного лечения этих заболеваний на сегодняшний день не существует. Учитывая то, что миодистрофии вызваны мутациями в генах, кодирующих мышечные белки, наиболее оптимальным подходом является генная терапия, позволяющая корректировать генетический материал клетки. В исследованиях по разработке генной терапии мышечных дистрофий возникает необходимость рассмотреть тот или иной подход (редактирование ДНК, РНК, ове-рэкспрессия, а также доставка терапевтических молекул различными векторами) не только теоретически, но и проанализировать in vitro. Учитывая распространенность ми-одистрофий, зачастую «труднодоступность» пациентов, многообразие мутаций и форм заболеваний, взятие био-птата для выделения и культивирования клеток в условиях лаборатории зачастую весьма затруднительно, или невозможно. Кроме этого, для создания молекул, действующих целенаправленно, на определенный участок ДНК или РНК, требуются образцы клеток, имеющих соответствующую мутацию. Таким образом, необходимо создание клеточных тест-систем (моделей заболеваний) в условиях лаборатории из уже имеющегося или легкодоступного биоматериала. Оптимальным сегодня является применение системы геномного редактирования CRISPRCas9. Нами выполнен дизайн молекулярного инструмента и получены лентивирусные частицы, содержащие трехкомпонентную систему транскрипционной активации CRIPSRCas9-SAM, в основе которой инактивированная нуклеаза Cas9 и факторы VP64, P65 и HSF1. В фибробла-стах, полученных от пациента с поясно-конечностной мышечной дистрофией 2Б (дисферлинопатией) с мутацией в 26 экзоне гена, кодирующего мышечный белок дисфер-лин (DYSF) был активирован ген DYSF. Селекцию транс-дуцированных клеток последовательно проводили антибиотиками (гигромицин, зеоцин, бластицидин). Уровень мРНК измерялся с помощью ОТ-ПЦР и составил около 40% от контрольного. Экспрессия дисферлина в контрольных фибробластах была подтверждена с помощью иммуноблоттинга. Таким образом, нами получена in vitro тест-система для отработки точных молекулярных инструментов для редактирования ДНК и РНК, а также подходов, связанных с оверэкспрессией белка дисферлина.

About the authors

Ivan Antonovich Yakovlev

Email: ivan@ivan-ya.ru

Irina Georgievna Starostina

Dar'ya Sergeevna Chulpanova

Alisa Almazovna Shaymardanova

Valeriya Vladimirovna Solov'eva

Al'bert Anatol'evich Rizvanov

Roman Vadimovich Deev

Artur Aleksandrovich Isaev

References

Supplementary files