Testirovanie sistem CRISPR/Cas na plyuripotentnykh kletkakh krysy

Abstract

Full Text

Лабораторная крыса является одним из основных объектов в области биологии и биомедицины. Данный объект широко используется для исследований в области физиологии, нейробиологии, фармакологии и изучения поведения, а также в области трансляционной медицины для изучения различных заболеваний человека и поиска подходов к их лечению. Для получения модельных животных применяют два подхода - это редактирование эмбрионов и внесение мутаций в плюрипотент-ные клетки с дальнейшей инъекцией в бластоцисту. Преимуществом использования плюрипотентных клеток является значительное сокращение количества необходимых для эксперимента животных. В настоящее время система CRISPR/Cas позволяет получать модели различных генетических заболеваний в достаточно короткие сроки. Однако для применения данной системы и редактирования генома в линиях плюрипотентных клеток крысы требуются эффективные подходы и протоколы. В данном исследовании была проведена работа по подбору оптимальных условий для внесения ДНК в плюрипо-тентные клетки крысы с помощью электропорации, а также по выбору наиболее эффективной системы CRISPR/ Cas для редактирования генома плюрипотентных клеток крысы. В ходе работы были протестированы три системы со следующими нуклеазами: Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Staphylococcus aureus CRISPR/Cas9 (SaCas9) и Acidaminococcus sp. BV3L6 Cas12a (AsCpf1). Для тестирования был выбран локус Rosa26, который является так называемым safe-harbor локусом и широко используется для внесения трансгенов в геном крысы. Для каждой системы были выбраны три протоспейсера в данном локусе. Оценку эффективности систем производили путем анализа образования инсерций и (или) делеций. В результате была выбрана оптимальная и эффективная система для редактирования генома плюри-потентных клеток крысы и, в частности, для внесения трансгенов в локус Rosa26 крысы.