Razrabotka geneticheskoy konstruktsii, kodiruyushchey geny α- i β-sub\"edinitsy β-geksozaminidazy A cheloveka i analiz ee funktsional'nosti v sostave genno- kletochnogo preparata dlya terapii bolezni Teya-Saksa

Abstract

Full Text

Болезнь Тея-Сакса является наследственным заболеванием, относящимся к группе лизосомных болезней накопления. Данное заболевание характеризуется недостаточностью фермента р-гексозаминидазы А (HexA) вследствие различных мутаций в гене а-субъединицы данного фермента, в результате чего происходит накопление GM2 ганглиозидов внутри лизосом преимущественно нервных клеток, что ведет к острой нейродегенерации. Характерными особенностями болезни Тея-Сакса являются мышечная слабость, атаксия и другие проблемы с движением, речевые проблемы и психические расстройства. На сегодняшний день заболевание остается неизлечимым. В настоящей работе разработан экспрессионный плазмидный лентивирусный вектор pLX303-HEXA-P2A-HEXB, содержащий гены, кодирующие а и р субъединицы фермента HexA, разделенные саморасщепляющимся P2A пептидом. Полученной плазмидой pLX303-HEXA-P2A-HEXB проведена генетическая модификация клеток НЕК293Т Ферментативную активность в кондиционированной среде трансцицированных клеток НЕК293T исследовали через 48 часов после трансфекции с применением флуоресцентных субстратов MUG и MUGS. Показано, что общая активность HexA в клетках, трансфицированных плазмидой pLX303-HEXA^2A-HEXB клетках увеличивается на 35%, а активность а субъединицы в 10 раз. Вестерн-блот анализ лизатов генетически модифицированных клеток НЕК293T показал наличие выраженной полоски, соответствующей ожидаемой молекулярной массе а и р субъединиц фермента HexA. Далее с использованием плазмиды pLX303-HEXA-Р2A-HEXB получали рекомбинантный лентивирус LV-HEXA-Р2А-HEXB. Полученным лентивирусом проводили генетическую модификацию (трансдукцию) мононуклеарных клеток пуповинной крови (МКПК) человека, после чего, генетически модифицированные МКПК-HEXA-Р2А-HEXB внутривенно вводили лабораторным крысам линии Вистар. После введения МКПК-HEXA-Р2А-HEXB, в плазме крови крыс отмечалось увеличение активности a субъединицы р-гексозаминидазы А. Наиболее высокая активность детектировалась на 6-9 сутки после введения. Таким образом, актуально дальнейшее исследование терапевтической эффективности и безопасности МКПК со сверхэкспрессией HexA для возможной разработки новых методов генно-клеточной терапии болезни Тея-Сакса. Использование МКПК в качестве векторов для доставки недостающего фермента HexA актуально благодаря возможности данных клеток преодолевать гема-тоэнцефалический барьер и оказывать также трофическую функцию для предотвращения нейродегенерации.