Razrabotka i validatsiya kombinirovannoy metodiki detektsii mikoplazm v chelovecheskikh kletochnykh liniyakh

Abstract

Full Text

Оценка микоплазменной контаминации - важный этап контроля качества клеточных линий, используемых при производстве биомедицинских клеточных продуктов. Предложенные в ГФ XIV методы анализа: микробиологический (культуральный) и цитохимический (индикаторной клеточной культуры) выполняются в течение нескольких суток, сложно стандартизуются, а их результат субъективно интерпретируется оператором. Альтернативные молекулярно-генетические методы анализа, наиболее широко используемым из которых является ПЦР, отличаются экспрессностью, однако менее чувствительны. Для достижения предела обнаружения микоплазмы, соответствующего фармакопейным требованиям, в проводили предварительное концентрирование испытуемых образцов - суспензий клеточной линии DF-2, 3x105 кл./мл (соответствует примерному содержанию клеток в продуктах клеточной терапии), в которые внесены микроколичества микоплазм M. arginini и A. laidlawii. Концентрирование проводили одним из двух способов: центрифугированием при 12000g (для осаждения клеток микоплазм) с последующим отбрасыванием супернатанта или центрифугальной ультрафильтрацией с использованием концентратора VivaSpin 6 100 kDa. Согласно полученным данным, каждый из предложенных способов концентрирования образцов обеспечивает надежную детекцию при их содержании, равном 10 КОЕ/мл. В качестве ключевых валидационных параметров аналитических методик детекции посторонних примесей, нормируемых по пределу содержания (к которым относятся, в т. ч. микоплазмы), в соответствии с ГФ XIV и EP 9.0, рассматривают «Специфичность» и «Предел обнаружения». Специфичность методик ПЦР-детекции микоплазм определяется селективностью связывания праймеров, входящих в тест-системы и валидируется на стадии разработки таких наборов. Предел обнаружения (L0D) методик ПЦР-анализа невозможно оценить по соотношению «сигнал-шум», поскольку сигнал холостого образца отсутствует. Подходом, позволяющим избежать подобного выбора, является вероятностный способ оценки предела обнаружения. Как было показано ранее, вероятность детекции аналита в образце методом ПЦР в концентрациях, близких к пределу обнаружения описывается функцией распределения Пуассона. Таким образом, можно принять L0D равным концентрации, обнаруживаемой с заданной статистически значимой вероятностью (95%). Предел обнаружения M. arginini в клеточных линиях с использованием разработанной методики, таким образом, составил 6,95 КОЕ/мл, A. laidlawii - 3,95 КОЕ/мл. Оба значения удовлетворяют требованиям EP, USP и ГФ.