Kharakteristika stvolovykh kletok limba cheloveka v zavisimosti ot metoda vydeleniya i usloviy kul'tivirovaniya

Full Text

Лимб является нишей стволовых клеток роговицы и содержит как эпителиальные (LESCs), так и стромальные стволовые клетки (CSSCs). Поиск новых оптимальных условий выделения и культивирования стволовых клеток лимба является базой для создания новых клеточных продуктов, используемых в лечении дефицита лимбальных стволовых клеток. Цель работы: характеристика стволовых клеток лимба при различных методах выделения и культивирования. Лимбальные стволовые клетки получали из области лимба энуклеированных по плановым медицинским показаниям глаз. Лимбальный графт отмывали, измельчали. Выделение клеток производили двумя методами: ферментативным и эксплантом. При ферментативном методе выделения клеток, лимб обрабатывали 0,05% раствором коллагеназы. Клетки культивтровали в стандартных условиях в полной среде DMEM/F12. После третьего пассажа проводили фенотипирование клеток и дифференцировку в адипогенном и остеогенном направлениях. При выделении клеток лимба методом экспланта в качестве фидера использовали силиковысушенную амниотическую мембрану (АМ). Фрагменты лимба на Ам культивировали в стандартных условиях в полной среде CECBM (Corneal Epithelial Cell Basal Medium). После закрытия большей части поверхности АМ, адгезированные клетки снимали и фенотипировали. Морфологию клеток оценивали с помощью микроскопов Axio Observer и электронного. Фенотип клеток определяли на проточном цитофлуори-метре. Статистическую обработку результатов проводили при помощи программы «Statistica 10,0». Полученная ферментативным методом культура первые сутки отличалась гетерогенностью клеток. К 2-3 пассажу культура была представлена, преимущественно, фибробластопо-добными клетками. Данные клетки обладали способностью к цитодифференцировке в адипогенном и остеогенном направлениях, большинство клеток экспрессировали маркеры ММСК (CD90+/CD73+/CD105+/CD34-/CD45-) и меньшее количество - маркеры эпителиальных клеток. При выделении клеток методом экспланта на 3-5 сутки были отмечены очаги миграции клеток. Клетки первичной культуры имели эпителиоподобную форму, хорошо адге-зировались к поверхности АМ, экспрессировали маркеры эпителиальных клеток (CK19+/p63a+/ABCG2+) и не несли маркеров ММСК. По данным электронной микроскопии клетки формировали 4-5 слоев на поверхности АМ. Таким образом, на основании морфологии клеток, результатов фенотипирования и цитодифференцировки, можно сделать заключение, что клетки, выделенные ферментативным методом, являются преимущественно CSSCs, а методом экспланта - LESCs.

About the authors

Mariya Aleksandrovna Surovtseva

Igor' Alekseevich Iskakov

Ol'ga Vladimirovna Poveshchenko

Aleksandr Petrovich Lykov

Irina Innokent'evna Kim

Evgeniya Viktorovna Yankayte

Natal'ya Anatol'evna Bondarenko

Natal'ya Petrovna Bgatova

Aleksandr Nikolaevich Trunov

Valeriy Vyacheslavovich Chernykh

References

Supplementary files