Modifikatsiya kletok HEK293A s ispol'zovaniem tekhnologii CRISPR-Cas9 SAM dlya transkriptsionnoy aktivatsii gena disferlina

Abstract

Full Text

Дисферлинопатии - группа мышечных дистрофий с аутосомно-рецессивным типом наследования, возникающие вследствие мутаций в гене дисферлина человека. Белок дисферлин (англ. Dysferlin, DYSF) играет ключевую роль в восстановлении сарколеммы при ее повреждении. Синтез дефектного белка приводит к нарушению репаративных процессов в мышечной ткани и последующей атрофии. Разнообразные исследования направлены на лечение этого наследственного заболевания, однако дисферлинопатия остается неизлечимой на данный момент. Одной из основных причин низкой эффективности методов лечения является отсутствие модели, наиболее точно воспроизводящей патологические процессы заболевания. Модели на основе животных широко используются, но ввиду значительных генетических различий они не способны в полной мере воспроизвести все особенности развития болезни в сравнении с человеком. Перспективным способом лечения дисферли-нопатии в настоящее время является генная терапия и модельные системы, основанные на клеточных линиях человека, экспрессирующих дисферлин, которые представляют интерес для тестирования новых генно-терапевтических препаратов. Целью нашей работы было создание тест-системы с использованием технологии CRISPR-Cas9 SAM in vitro для разработки и скрининга препаратов для лечения дисферлинопатии. Активацию транскрипции мРНК гена DYSF в клетках HEK293A осуществляли с использованием полученных рекомбинантных лентивирусов, кодирующих факторы транскрипции MS2-P65-HSF1, dCas9-Vp64 и специфическую гидовую РНК дисферлина. Селекцию успешно трансдуцирован-ных клеток проводили рядом антибиотиков (зеоцин, бла-стицидин, гигромицин), специфичных соответственно каждому лентивирусу, с целью получения чистой популяции инфицированных клеток. Экспрессия белка дисфер-лина была подтверждена с помощью вестерн-блоттинга. Клеточная линия HEK293A с экспрессией дисферлина, полученная путем транскрипционной активации гена DySf с использованием системы CRISPR-Cas9 SAM, может быть использована в дальнейших исследованиях терапевтического подхода путем редактирования РНК и ДНК клеток, а также для скрининга лекарственных препаратов при лечении дисферлинопатий человека.