Differentiation of PC cells into hepatocytes and liver repopulation

Abstract

The review is devoted to the search for new [non-hematopoietic] stem and progenitor cell populations of human umbilical cord blood, the possibilities of their isolation and therapeutic use. For convenience, the review is divided into several chapters, at the end of each of which there is a separate list of references.

Full Text

3 года назад появились первые работы, показывающие возможность дифференцировки клеток ПК человека в клетки печени. Способность к энграфтингу и дифференцировке ПК в печени изучали на модели ксенотрансплантации мышам с врождённым иммунодефицитом - SCID. Модель позволяет проводить ксенотрансплантации без иммуносупрессии.

В пилотной работе Beerheide [1] пластик-адгезивную фракцию клеток ПК, культивированную в течение 2-3 недель, пересаживали под капсулу регенерирующей [после частичной гепатэктомии] печени SCID-мышей. Через неделю после трансплантации наблюдали engraftment меченых человеческих клетоки экспрессию ими человеческого альбумина [чего не наблюдали до трансплантации]. В контроле введение нефракционированной мононуклеарной фракции ПК не приводило к экспрессии ни одного человеческого маркёра [1].

В нескольких работах [2, 6, 9] нефракционированные ядросодержащие клетки ПК пересаживали облучённым NDD/SCID мышам без нарушения функции [2] или с повреждением печени [токсический гепатит, гепатэктомия] [6, 9]. Энграфтинг в печень наблюдали от одной до нескольких недель после трансплантации. В работе Newsome [2] дифференцировавшиеся клетки человека в криосрезах печени идентифицировали через 4 недели по специфическим антителам - НерРагІ, связывающимся только с гепатоцитами человека [перекрёстные реакции были исключены]. Все используемые методы подтвердили наличие человеческих клеток, морфологически выглядевших как гепатоциты в печени мышей-реципиентов. Маркёры холангиоцитов и эндотелиальных клеток, содержащих человеческую ДНК идентифицированы не были [2]. Kakinuma [6] показал, что при внутрипортальной трансплантации свежевыделенных ЯСК

ПК SCID-мышам с частичной гепатэктомией и токсическим гепатитом было показано их долговременное [более года] приживление и дифференцировка в альбумин-продуцирующие гепатоциты.

Более детальное изучение клеточных популяций ПК, способных к репопуляции печени и дифференцировке в гепатоциты, подтвердило, что это могут быть совершенно различные по природе и функции клетки. В исследовании Ishikawa [3] мышам вводили очищенные CD34⁺ клетки ПК. Через 4-5 месяцев иммуногистохимически в печени идентифицировали гепатоциты человека по мРНК человеческого альбумина. Интересно, что степень химеризации костного мозга мышей-реципиентов составила 21-46% человеческих гемопоэтических клеток [3]. Однако, в другой работе на модели Fas-лиганд-опосредованного повреждения печени не было показано никакой разницы в химеризме печени и способности к экспрессии маркёров гепатоцитов между С034⁺ и CD34 клетками ПК после их ксенотрансплантации [10]. Аналогичные результаты были получены Danet при трансплантации субпопуляций Lin^_/CD45⁺/CD38“/CD34⁺or^_/ C1qR[p]⁺ [4]. При ксенотрансплантации С034⁺/С038^_/ 007 гемопоэтических клеток ПК в условиях токсического гепатита наблюдали энграфтинг и появление альбумин [м- РНК]-позитивных клеток человека в печени мышей. Как и в работе [1], человеческий альфа-фетопротеин не определялся, однако у некоторых животных экспрессировался человеческий цитокератин-19 [СК-19] - маркёр холангиоцитов. В сыворотке крови определяли человеческий альбумин. У контрольных животных [с гепатитом, без клеточной терапии] человеческий альбумин ни в печени, ни в сыворотке не выявлялся. Эффект трансплантации усиливался введением человеческого фактора роста гепатоцитов через 48 ч после моделирования острого токсического гепатита [5].

В некоторых работах [2, 3] методом FISH-гибридизации авторы исключают феномен слияния донорских клеток с хозяйскими. Однако в других работах были получены явные признаки клеточного слияния [9, 11]. Ряд авторов этот феномен не изучали, однако не исключают такой механизм маскировки трансдифференцировки клеток ПК в гепатоциты [10, 12]. Таким образом, недавние более детальные морфологические исследования [11] ставят под сомнение возможность трансдифференцировки клеток ПК в гепатоциты in vivo.

Таким образом, во всех этих работах было показано, что клетки ПК встраиваются в печень мышей и экспрессируют маркёры гепатоцитов. Кроме того, такие клетки функционировали и синтезировали альбумин [5, 6]. Энграфтинг человеческих клеток в печень мышей обеспечивала иммунонекомпетентность организма реципиента. Для этого использовали SCID мышей [1-7] или преиммунные стадии развития эмбрионов [8].

Таблица 2. Характеристика основных экспериментов по дифференцировке клеток ПК в гепатоцитов

Авторы, ссылка	Клетки ПК до индукции/ трансплантации	Модель	Наблюдения, результат
Beerheide W. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 294: 1052	Пластик-адгезивная культура, p2-microglobulin+ /a1-antitrypsin+	Частичная гепатэктомия	β2-microglobulin-/a1- antitrypsin+/Albumin+ энграфтинг введённых клеток
Newsome P.N. et al. Gastroenterol. 2003; 124: 1891	Свежие нефракционированные мононуклеарные клетки	NOD/SCID-мыши без нарушения функции печени	Энграфтинг, НерРаг1 + клетки человека, имеющие типичную морфологию гепатоцитов
Danet G.H. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2002; 99: 10441	Lin7CD457CD387CD34+or- /C1qR(p)+	NOD/SCID-мыши без нарушения функции печени	Энграфтинг, Human Albumin+ гепатоциты
Wang X. et al. Blood 2003; 101(10): 4201	CD34TCD387CD7-	Токсический гепатит	Human Albumin+ гепатоциты, Human СК-19+ холангиоциты, Human Albumin в сыворотке крови
Kakinuma S. et al. Stem Cells 2003; 21(2): 217	Свежие нефракционированные мононуклеарные клетки	Токсический гепатит + частичная гепатэктомия	Human Albumin+ гепатоциты, Human Albumin в сыворотке крови
Sharma A.D. et al. Am. J. Pathol. 2005; 167: 555	Свежие нефракционированные мононуклеарные клетки	Токсический гепатит	Human HepPar1+/human Albumin+Zmouse CK-18+ гепатоциты
Lee K.D. et al. Hepatology 2004; 40(6): 1275	Пластик-адгезивные CD137 CD347CD457CD1337SH27 SH37CD29TCD44TCD737 CD907CD105+ клетки	In vitro HGF + bFGF, без сыворотки	Гепатоцитоподобные клетки, экспрессирующие ряд характерных генов и маркёров (Albumin, HNF-4, Р450), продукция гликогена и мочевины
Nonome K. et al. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2005; 289: G1091	CD34+ и CD34-	Fas-повреждение печени	Albumin+/AFP+ гепатоциты, увеличение выживаемости животных
Hong S.H. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 330: 1153	Пластик-адгезивные Thy-1 + /Flt3-/c-Kit-	In vitro + HGF	Thy-1+/Flt3+/c-Kit+/Albumin+ /AFP+/CK-18+/CK-19+ гепатоцитоподобные клетки

В ряде работ показана возможность генерации клеток печени in vitro из различных популяций ПК. Kakinuma использовал комбинацию из 5 факторов роста для стимуляции дифференцировки ЯСК ПК. Через 3 недели культивирования до 50% клеток экспрессировали альбумин и коэкспрессировали ещё 5 других печёночных маркёров, включая маркёры зрелых гепатоцитов, овальных клеток и холангиоцитов [6]. Были получены гепатоцитоподобные клетки и из пластик- адгезивной «мезенхимальной» фракции ПК [13, 14]. Основным фактором индукции, используемым всеми исследователями являлся фактор роста гепатоцитов [HGF], В работе Nonome [10] стимулировали экспрессию маркёров различных клеток печени в культуре гемопоэтических С034⁺ и 0034“ клеток ПК. Результаты основных исследований по дифференцировке клеток ПК в клетки печени и её репопуляции представлены в таблице 2.

Вероятность дифференцировки клеток ПК в гепатоциты in vivo остаётся крайне низкой и, видимо, мало зависит от степени повреждения-регенерации органа и фракционирования трансплантата. Так, в эксперименте [4] внутривенно вводили очищенные CD45⁺/CD38“/CD34⁺or^_/C1qRp клетки ПК и выявляли популяцию человеческих HLA-ABC+ гепатоцитов, которая составляла 0,05-0,1% от общего количества клеток печени мыши-реципиента [3]. С другой стороны, внутрипортальная трансплантация нефракционированных ЯСК, но уже в модели повреждения печени, приводила к максимальной 0,1-1% репопуляции органа [6]. А в работе [2] энграфтинг в печень мышей составлял только 0,017% от общего количества введённых клеток. Неизвестно, достаточно ли такого низкого уровня энграфтинга и химеризма для достижения значимого терапевтического эффекта? Только единичные работы [7, 10] показывают значимое снижение летальности на фоне терапии токсического гепатита клетками ПК. Тем не менее, недавно было опубликовано первое клиническое исследование по эффективности клеточной терапии клетками ПК-вирусных гепатитов [16]. Показано, что аллогенная трансплантация клеток ПК приводит к улучшению функции печени и иммунной системы у больных с вирусными гепатитами. К сожалению, в сообщении отсутствует информация о подготовке клеток трансплантата и степени их совместимости с реципиентом [16].