Successful induction of pluripotent stem cells from neural stem cells using two factors

Full Text

В большинстве научных исследований для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (induced pluripotent stem cells, iPS cells), независимо от использующейся исходной клеточной популяции (фетальные или взрослые кожные фибробласты, синовиоциты и др.), применяется стандартный набор факторов, включающий Oct4, Sox2, c-Мyc, Кlf4, Nanog, Lin28, высокий уровень экспрессии которых характерен для ЭСК [1, 2]. Авторы отдают предпочтение разным индукторам с учетом их функциональной значимости, но приемлемые положительные результаты достигаются лишь с применением квартета факторов. Принимая во внимание установленный негативный эффект реактивации c-Мyc в виде индукции апоптоза [4] и опухолевой трансформации iPS клеток [5], целесообразна разработка протоколов с уменьшением количества факторов, необходимых для репрограммирования. В перспективе, это позволило бы повысить безопасность применения культур iPS клеток, что крайне необходимо для проведения клинических испытаний.

Теоретически, сокращение количества экзогенных индукторов репрограммирования возможно при достаточной эндогенной экспрессии некоторых из них. Так, например, нейральные стволовые клетки (НСК) характеризуются высоким уровнем экспрессии Sox2 (в два раза выше по сравнению с ЭСК) [6, 7], который, регулируя активность генов, ответственных за пролиферацию и дифференцировку, поддерживает мультипотентный статус клеток [8]. Кроме того, J.B. Кim с соавт. показали практически равное содержание белка, кодирующегося геном c-Мyc, в НСК и ЭСК, а также экспрессию Кlf4, уровень которой в восемь раз ниже по сравнению с ЭСК. уководствуясь этими данными, J.B. Кim с соавт. предприняли исследование, в котором выполняли репрограммирование нейральных стволовых клеток (НСК) с использованием всего двух факторов.

На первом этапе эксперимента исследователи установили возможность репрограммирования НСК посредством трансфекции ретровирусными векторами, содержащими четыре фактора: Oct4, Sox2, c-Мyc, Кlf4. Соответствие полученных iPS клеток и ЭСК доказали по стандартному плану, предусматривающему изучение морфологии, иммунофенотипа, генетических характеристик, наличия тератом при подкожном введении. Затем авторы с целью репрограммирования вводили в НСК различные комбинации трех из четырех указанных факторов. При этом в каждом случае одним из индукторов являлся Oct4, а два других менялись. Положительные результаты наблюдались при использовании любого варианта, однако различия заключались в сроке формирования колоний iPS клеток. Так, при трансфецировании НСК комплексом Oct4 - Кlf4 - с-Мyc репрограммирование завершалось к концу первой недели, при использовании вектора Oct4 - Кlf4 - Sox2 - за 2-3 нед., а в случае Oct4 - c-Мyc - Sox2 получение культуры iPS клеток осуществлялось в течение более длительного времени. Указанные данные свидетельствуют о возможности репрограммирования НСК всего тремя индукторами в отсутствии любого из экспрессирующихся эндогенно (c-Мyc, Sox2, Кlf4), причем время получения колоний iPS клеток обратно пропорционально эндогенному уровню экспрессии фактора, отсутствующего в ретровирусном векторе.

В дальнейшем, исследователи оценивали эффективность репрограммирования НСК различными комбинациями из двух индукторов. Оказалось, что к формированию колоний iPS клеток приводят лишь два варианта: наиболее быстро - Oct4 - Кlf4, а на одну-две недели медленнее - Oct4 - c-Мyc. Затем, авторы сравнивали свойства клеточных культур, полученных при использовании Oct4 - Кlf4 и квартета факторов между собой, а также с ЭСК. Установили, что морфологически идентичные колонии различных клеточных популяций характеризуются сходным уровнем экспрессии генов-маркеров ЭСК (Oct4, Nanog, Sox2, Fgf4, Eras, Cfc1, Zfp42, Utf1, Dppa5a), а также были позитивны по SSEA-1. Кроме того, методом ПЦР с обратной транскрипцией было показано, что iPS клетки, полученные при использовании двух индукторов, и ЭСК характеризуются одинаковыми уровнями экспрессии эндогенных Oct4, Sox2, c-Мyc и Кlf4 с тысячекратным понижением активности ретровирусных факторов через 30 дней после трансфекции.

Плюрипотентность сравниваемых культур iPS клеток была подтверждена формированием эмбриоидных телец, дифференцировкой в кардиомиоциты, образованием подкожных тератом, клетки которых экспрессировали маркеры эктодермальной (Тuj1), эндодермальной (AFP) и мезодермальной (Flk1) принадлежности. Инъекция iPS клеток, полученных при репрограммировании двумя факторами, в диплоидные и тетраплоидные бластоцисты приводила к формированию химер, которые в первом случае были жизнеспособны. При этом клетки, являющиеся производными разных зародышевых листков, несли маркер (GFP), что указывает на их происхождение от введенной культуры клеток, геном которых содержит ретровирусный вектор, маркированный GFP.

Таким образом, показана возможность репрограммирования соматических клеток (НСК) всего двумя факторами за счет эндогенной экспрессии остальных. Особенно важно, что положительные результаты достигаются и без применения ретровирусных векторов, содержащих c-Мyc, который вносит существенный вклад в опасность опухолевой трансформации iPS клеток.

About the authors

I. Y. Bozo

Author for correspondence.
Email: bozo.ilya@gmail.com

References

Supplementary files