Нейрональная дифференцировка и применение клеток ПК в неврологии

Abstract

The review is devoted to the search for new [non-hematopoietic] stem and progenitor cell populations of human umbilical cord blood, the possibilities of their isolation and therapeutic use. For convenience, the review is divided into several chapters, at the end of each of which there is a separate list of references.

Full Text

По лечебному потенциалу клеток ПК в экспериментальной неврологии к настоящему времени уже написаны обзоры [19, 20]. Подоплёкой к исследованиям по терапевтической эффективности трансплантации клеток ПК в неврологии послужили работы по выделению и характеристике нейрональных клеток из «стволовых популяций» ПК.

Из различных популяций клеток ПК in vitro несколькими группами исследователей были получены все виды нервных клеток. Пионерские работы по получению нейрональных клеток из ПК были выполнены группами Sanchez-Ramos и Buzanska [1-3]. Пластик-адгезивные клетки и 0034 /0045 клетки были размножены и подвергнуты дифференцировке под влияниям ретиноевой кислоты [RA] и других факторов роста [EGF, BDNF] [1-4]. Причём ретиноевая кислота выступает в данном случае основным нейроиндуктором [1]. Другие группы исследователей подвергали дифференцировке 0045 [5], CD133⁺ [6] и мезенхимальные клетки ПК [7, 8].

Исходя из результатов этих исследований, было констатировано, что различные популяции стволовых и прогениторных клеток ПК могут быть подвергнуты дифференцировке in vitro во все виды нервных клеток. Это было показано не только исследованием их иммунофенотипа, но и данными по экспрессии генов [мРНК] и характерных транскрипционных факторов [1-8]. Однако наблюдается недостаток экспериментов in vivo на различных неврологических моделях, которые могли бы подтвердить функциональную значимость полученных клеток.

□дна из таких работ, демонстрирующая дифференцировку клеток ПК in vivo, была выполнена группой Zigova [9]. Пластик-адгезивную мононуклеарную предифференцированную фракцию ПК пересаживали унилатерально в желудочки головного мозга новорожденых крысят без иммуносупрессии. Через месяц после трансплантации было выявлено, что около 20% выживших клеток оказывались в субвентрикулярной зоне и только 2% из них экспрессировали GFAP[маркёр микроглии]. Миграции клеток, характерной для нейрональных стволовых, не наблюдали. Возможной причиной низкой выживаемости, отсутствия миграции и дифференцировки в нейроны, является трансплантация весьма гетерогенной популяции клеток в иммунокомпетентный мозг крысы [9].

Таким образом, результаты экспериментов in vitro пока не подтверждены данными in vivo. Вопрос об истинной дифференцировке, отсутствии артефактов [12] и ложноположительных результатах остаётся открытым. Самый часто применяемый индуктор - ретиноевая кислота, возможно, не обладает «достаточной нейроспецифичностью» и вместе с другими индукторами может вызывать плеойтропные эффекты на повышение уровня экспрессии генов других поверхностных маркёров в культуре. Так известно, что как гемопоэтические клетки, так и мезенхимальные стромальные клетки костного мозга спонтанно экспрессируют нейрональные маркёры [10, 11]. Различные добавки в виде факторов роста в культуру могут лишь усиливать экспрессию этих генов, не вызывая прямой дифференцировки в функциональнополноценный нейрон.

Результаты экспериментов по нейрональной дифференцировке клеток ПК изложены в таблице 1.

Терапевтические эффекты, вызываемые трансплантацией клеток ПК, были изучены на нескольких моделях неврологического дефицита. В одной из ранних работ было показано, что внутривенная трансплантация гемопоэтических CD34⁺ клеток [77-95% в трансплантате] ПК крысам с моделью ишемического инсульта приводит к значимому функциональному восстановлению неврологического дефицита. Клетки мигрировали в головной мозг, преимущественно - в зону поражения, и дифференцировались в нейроны и клетки глии [GFAP+, NeuN+, МАР-2+] [13]. В исследовании, опубликованном в Journal Clinical Investigation, также была показана эффективность трансплантации CD34⁺ клеток, выделенных из ПК для лечения ишемического инсульта у иммунодефицитных мышей [14]. Группа Willing сравнила внутривенный и интрастриальный способы трансплантации клеток ПК [на фоне иммуносупрессии] крысам с моделью ишемического инсульта [15]. По результатам некоторых функциональныхтестов исследователи заключили, что внутривенное введение клеток может быть даже терапевтически выгоднее интрастриального [15]. При изучении эффектов трансплантации мононуклеарных человеческих клеток ПК на модели ишемического инсульта у крыс наблюдали дозозависимый эффект достоверного улучшения поведенческих реакций и двигательной активности животных через 2 и 4 недели после трансплантации. Оказалось, что максимально эффективно введение клеток ПК в дозе 1 и 10 миллионов. Введённые клетки обнаруживали в головном мозге в периинсультной зоне эпсилатеральной стороны. Клеточная трансплантация значимо «уменьшала» область повреждения [16].

Интересное исследование, выполненное Borlongan [17], показывает, что клетки ПК не мигрируют через гематоэнцефалический барьер [ГЭБ], а только стимулируют эндогенный нейро- и ангиогенез. В подтверждение этого было выявлено повышение концентрации GDNF [glial cell line-derived neurotrophic factor] на 68% в головном мозге инсультных животных после введения клеток и маннитола [повышающего проницаемость ГЭБ]. Концентрация 3 нейротрофических факторов [GDNF, NGF, BDNF] повышалась и в периферической крови приблизительно на 15% в группе животных, получавших клеточную трансплантацию с маннитолом. В остальных группах уровень этих факторов был недетектабелен [17].

Таблица 1. Характеристика основных экспериментов по нейрональной дифференцировке клеток ПК

Ссылка	Тип клетки ПК до индукции дифференцировки	Индукторы дифференцировки	Тип клеток после индукции дифференцировки
Sanchez-Ramos J.R., et al. Exp Neurol 2001; 171: 109-115	Мононуклеарные, пластик-адгезивные	RA+ NGF	Musashi-1+; P-tubulin lll+/NeuN+; GFAP+
Buzanska L., et al. J. Neurochem 2001; 78 (Suppl. 1): 58	CD34-/CD45- пластик-адгезивные, несколько пассажей, Nestin+	RA (4 дня), BDNF, кокультура с нейрональными клетками эмбриона крысы 4-8 дней	III β-tubulin+ ; GFAP+/MAP2+; PLP+/DM-20+; GalC+
Bicknese A.R., et al. Cell Transplant 2002; 11; 3: 261-264	CD45(-), мононуклеарные	bFGF + EGF, 7 дней	β-tubulin III+; GFAP+; GalC+
Jang Y.K., et al. J. Neurosci Res 2004; 75; 4: 573-584	CD133+	RA	Musashi-1+ ; P-tubulin-lll+; NSE+, GFAP+ MAP-2+, MBP+, PLP+; NF-L, -M, -H Otx2, Pax6, Wnt1, Olig2, Hashl and NeuroDI
Jeong Ju. Ah., et al. Neuroreport 2004; 15; 11: 1731-1734	Пластик-адгезивные (мезенхимальные) SH2+/CD13+/CD29+/ CD105+/ASMA+	bFGF, DMSO, butylated hydroxyanisole (BHA)... 1-4 дня	Tuj1+, TrkA+, GFAP+, CNPase+, MAP-2+, NeuroD1 +
Zigova T., et al. Cell Transplant. 2002; 11; 3: 265-274	«Стромальные» пластик-адгезивные клетки	RA+NGF	TuJ-1+, GFAP+ in vivo

Таким образом, лечение экспериментального ишемического инсульта трансплантацией клетками ПК эффективно за счёт стимуляции эндогенного нейро- и ангиогенеза. Неясной остаётся способность миграции клеток в повреждённый головной мозг через ГЭБ. Способно ли радикальное повышение количества [как показано в первом исследовании] вводимых клеток вызвать их миграцию через ГЭБ? Если экстраполировать дозозависимую терапию на человека, то для достижения эффекта понадобится около 20 доз размороженных проб ПК [согласно первому исследованию].

Различные работы продемонстрировали примерно схожие эффекты трансплантации клеток ПК при экспериментальном инсульте, несмотря на разницу в количестве вводимых клеток [1-Ю миллионов или 200 тысяч] и степени очистки трансплантата [мононуклеарные или CD34⁺ клетки]. Отсюда можно сделать вывод, что терапевтический эффект, по-видимому, обусловлен факторами, выделяемыми мононуклеарными клетками ПК в условиях неврологического дефицита in vivo, вне зависимости от событий прямой дифференцировки или слияния какой-либо конкретной стволовой или прогениторной популяции трансплантата. Схожие результаты [функциональное восстановление и данные по дифференцировке] были получены и при внутривенной трансплантации клеток ПК в модели повреждения головного мозга у крыс [18].

Складывается впечатление, что терапевтическое действие клеток ПК при неврологическом дефиците неспецифично и не обусловлено их нейрональной дифференцировкой. Тем не менее, базируясь на данных экспериментальных исследований, несколько групп в разных странах приступили к клиническим испытаниям такого метода клеточной терапии. Совсем недавно появилось первое сообщение о восстановлении моторной функции [ходьбы] через 17 лет после травмы спинного мозга у парализованной женщины, после трансплантации клеток ПК [21].