Negistonovye belki HmgB1 i HmgB2 v khromatine embrional'nykh stvolovykh kletok myshi

Abstract

Full Text

Целью данной работы является исследование роли негистоновых белков HmgB1 и HmgB2 в изменениях структурно-функциональных параметров хроматина ЭСК мыши в процессах дифференцировки. Актуальность исследования в контексте применения ЭСК в медицинской практике обусловлена необходимостью дополнения и систематизирования сведений о роли данных белков в хроматине ЭСК вследствие выявленной зависимости (литературные данные) скорости пролиферации ЭСК, роста злокачественных образований, распространения метастаз и протекания большей части молекулярных механизмов хронического воспаления и заживления от уровня экспрессии и, возможно, статуса пост-трансляционных модификаций HmgB1 и HmgB2. В рамках поставленных целей нами была создана (методами молекулярного клонирования и CRISPR/Cas9 технологии) линейка нокаутных по HmgB1 и HmgB2 ЭСК мыши. Показано, что CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут генов HmgB1, HmgB2 и HmgB1;HmgB2 одновременно оказывает влияние на фенотип ЭСК, но не приводит к потере их жизнеспособности. С помощью тератом и направленной дифференцировки in vitro мы также показали, что нокаут генов HmgB1, HmgB2 и HmgB1;HmgB2 не оказывает существенного влияние на саму способность дифференцироваться во все три зародышевых листка. Однако, в случае дифференцировки ЭСК нокаут-ных по HmgB2 и HmgB1;HmgB2 клеток при переходе из наивного (до имплантации) в праймированное (пост-имплантационное) состояние плюрипотентности in vitro наблюдаются задержка дифференцировки и массовая гибель клеток на 5-6 сутки после ее запуска. С помощью FT(ICR)MS нами выявлены функционально значимые различия в статусе пост-трансляционных модификаций HmgB1 дифференцированных и ЭСК мыши, в частности АсК2 и deAcK81 (ЭСК), что, согласно литературным данным, приводит к потере способности изгибать ДНК при связывании и, вероятно, должно повлечь за собой изменение функциональной нагрузки HmgB1 в хроматине ЭСК. С целью исследования биологической роли данных модификаций методами молекулярного клонирования (точечный мутагенез) и CRISPR/Cas9-опосредованного нокина генов в настоящее время ведется работа по созданию клеточных линий с мутантной формой белка. Полученные в ходе выполнения работы сведения помогут лучше понять и, следовательно, контролировать процессы дифференцировки ЭСК и тем самым, ускорят внедрение плюрипотентных стволовых клеток в практическую медицину.