Sozdanie novogo sinteticheskogo myshechnospetsificheskogo promotora

Abstract

Full Text

Генная терапия на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) - наиболее перспективный подход лечения миодистрофии Дюшенна. Одним из основных недостатков AAV является его малая емкость (4,7 кБ), большую часть которой занимает микроген дистрофина (3,5 кБ). При этом необходимо обеспечить высокий уровень экспрессии белка строго в мышцах, чтобы избежать иммунного ответа. Целью нашей работы было создание высокоэффективного мышечно-специфичного синтетического промотора размером не более 0,5 кБ. Для тестирования новых промоторов был сконструирован вектор для сборки AAV-eGFP, в 5'UTR области которого расположен сайт для клонирования синтетического промотора перед последовательностью минимального CMV-промотора. В 3'UTR расположен сайт рестрикции для вставки баркода. Для оценки множественности инфекции в векторе также закодирован FusionRed под конститутивным CMV промотором. После клонирования в вектор промоторных последовательностей и последующего отбора наиболее эффективных кандидатов, с полученными конструкциями будут собраны AAV9-eGFP вирусы для внутривенных инъекций мышам и сравнительного анализа экспрессии eGFP с разных промоторов. В ходе работы были проанализированы данные РНК-секвенирования с целью выявить гены, экспрессирующиеся исключительно в мышечной ткани. Затем в их промоторных областях были определены повторяющиеся мотивы - TFBS. Было синтезировано 20 вырожденных мотивов, среди которых 10 ранее неизвестных TFBS и 10 уже известных по литературным данным. Несколько копий индивидуальных TFBS лигировали и клонировали перед minCMV. С данными векторами собирали AAV-Dj-eGFP вирусы, которыми инфицировали культуру мышечных клеток MB135. По результатам экспериментов выявили группы мотивов, которые обеспечивали высокий, средний и минимальный уровень экспрессии Gfp. В дальнейший анализ брали мотивы с высокой и средней эффективностью. Такие вырожденные TFBS рандомно лигировали друг с другом и клонировали в вектор для создания библиотеки промоторов. С полученной библиотекой будут собраны AAV-Dj-eGFP вирусы для инфекции MB135. На клеточном сортере, основываясь на данных экспрессии FusionRed, будет отобран пул клеток, в которые попала единичная копия вируса, и отсортированы клетки с максимальным уровнем экспрессии Gfp. Далее, отобранные промоторы будут переклонированы в векторы с баркодом, где каждому промотору будет соответствовать индивидуальный баркод. Полученный синтетический промотор с заданными свойствами должен обеспечить высокую тканеспецифичную экспрессию трансгена.